Фенотипические потенции особи определяются в основном генетической информацией, содержащейся в ее хромосомах, а также до некоторой степени влиянием внешней среды.
Мы приняли в качестве рабочей гипотезы еще более определенное предположение, а именно, что фенотипическая картина, выраженная организмом, представляет собой суммарный результат всех физических и каталитических эффектов, производимых набором белковых молекул, характеризующих данный вид. Иными словами, мы допускаем, что генетическая информация, содержащаяся в организме, сначала реализуется в структуре белка, причем каждый ген — либо сам по себе, либо совместно с другими генами — определяет ту или иную деталь структуры соответствующей молекулы белка. Например, мы можем считать, что строение и физиологические свойства гемоглобина определяются одним геном (или цистроном) или же несколькими взаимодействующими генами, каждый из которых определяет структуру одной из пептидных цепей гемоглобина, характер их свертывания и образование поперечных связей между ними. Далее, биосинтез и строение небелковых веществ, таких, как углеводы и жиры, их распределение и интеграцию в определенные клеточные системы можно рассматривать как результат деятельности белков, служащих агентами генотипа в форме ферментов, гормонов и субмикроскопических морфологических элементов.
Поскольку мутация даже одного гена, сопровождающаяся «весьма незначительным изменением в строении какого-либо одного белка (примером может служить гемоглобин крови больных с серповидноклеточной анемией), вызывает заметные изменения в фенотипическом поведении организма, вопрос о том, насколько точны механизмы, осуществляющие синтез белков, и оценка степени допускаемой ими неточности приобретают первостепенное значение. Если изменение в строении белка, затрагивающее лишь один аминокислотный остаток, может вызвать заметное изменение его функции, то имеются все основания опасаться влияний случайной неоднородности белковых структур, вызванной ошибками биосинтеза. Говоря о том, что синтез белка контролируется генами, необходимо иметь какое-то представление о границах, в которых осуществляется этот контроль. Современные методы физико-химического изучения белков дают возможность обнаружить отсутствие однородности в препаратах белков даже в тех случаях, когда оно вызвано чрезвычайно мелкими различиями, например наличием или отсутствием одной амидной группы у части молекул, находящихся в растворе. Неоднородность «чистых» белков может стать даже более заметной с течением времени. Несмотря на наличие таких превосходных методов, как ионообменная хроматография на колонках, наполненных ионообменной смолой, противоточное распределение и электрофорез, приходится признать, что критерии однородности весьма относительны и что неоднородность, которую не удается обнаружить современными методами, возможно, в недалеком будущем будет выявлена при помощи новых, еще более тонких приемов.
Поскольку белки представляют собой очень сложные органические вещества, они, естественно, существуют в виде большого числа изомеров. Подобные изомеры легко разбить на две большие группы, используя для этих групп названия, предложенные Штейнбергом и Михали в их последнем обзоре по химии белка. Вариации в строении белка могут быть связаны с двумя типами изомерии: первый касается последовательности расположения аминокислот, второй — конфигурации молекулы. Первый тип изомерии связан с различиями в последовательности аминокислот в разных молекулах; к нему для удобства отнесены также случаи, обусловленные различиями в ковалентных связях (дисульфидных мостиках, фосфорно-эфирных связях и амидных группах). Это стабильные, четко выраженные параметры строения, не изменяющиеся при обычных методах обработки белков, при их очистке и хранении. Второй же тип изомерии может быть связан с различиями в характере скручивания пептидных цепей, а также в расположении нековалентных связей, их частоте и стабильности. Наличия такой изомерии следует ожидать в водных растворах, поскольку на связи, ответственные за вторичную и третичную структуру белка, сильно влияют кислотность, полярность и температура среды.
Кольвин, Смит и Кук перечислили описанные в литературе случаи обнаружения отсутствия гомогенности в препаратах белков, казавшихся высокоочищенными. Мы ограничимся лишь несколькими примерами: при электрофорезе лизоцима, рибонуклеазы и яичного альбумина было выявлено обратимое расширение границ; гамма-глобулин человека оказался гетерогенным при исследовании его как методом электрофореза, так и ультрацентрифугированием, а инсулин удалось разделить на два компонента методом противоточного распределения. Указанные авторы предпочли истолковать эти экспериментальные результаты как свидетельство «микрогетерогенности» структуры и высказали мнение, что нативный белок, по-видимому, состоит не из конечного числа определенных химических единиц, а представляет собой популяцию весьма близких «особей», отличающихся друг от друга по некоторым особенностям, либо дискретным, либо образующим непрерывный ряд изменений. Они высказали мнение, что если «микрогетерогенность» будет обнаружена у всех нативных белков, то тем самым отпадет необходимость предполагать наличие специфичных и неизменных клеточных механизмов синтеза белка и что один «вид» белков может состоять из широкого спектра различных «подвидов» белков, отличающихся друг от друга по ферментативным, гормональным или физико-химическим свойствам. На основе сведений, имевшихся в 1954 г., когда Кольвин, Смит и Кук писали свой обзор, такой вывод представлялся обоснованным. Однако в настоящее время ясно, что многие примеры, послужившие в то время для доказательства концепции «микрогетерогенности», можно было использовать для этой цели лишь потому, что химия этих, белков была тогда изучена недостаточно. Например, рибонуклеазу поджелудочной железы быка при помощи хроматографии на колонках можно разделить на два компонента, содержащихся в ней в больших количествах, и на два других, присутствующих в незначительных количествах. Сходное «семейство» рибонуклеаз было выделено из поджелудочной железы барана. По-видимому, эти четыре компонента присутствуют в ткани поджелудочной железы в норме, поскольку их удается выделить и из очищенного кристаллического материала и из неочищенных экстрактов поджелудочной железы. Электрометрическое титрование двух главных компонентов рибонуклеазы, выделенных из поджелудочной железы быка, показало, что они различаются лишь по одной карбоксильной группе (или, наоборот, по одной амидной группе). Поэтому у нас гораздо больше оснований отказаться от концепции широкой «микрогетерогенности» в смысле наличия спектра родственных веществ, и сделать заключение, что «рибонуклеаза» представляет собой не статистическую популяцию родственных белков, а скорее ограниченную группу определенных химических единиц.
Полную однородность в смысле последовательности аминокислотных остатков в любом образце белка можно установить лишь после количественного выявления всех фрагментов, на котором основывается восстановление последовательности. Практически этого оптимального положения ни в одном случае достигнуть не удалось. Для всех изученных до настоящего времени белков и полипептидов об однородности в смысле последовательности можно судить лишь на основании того факта, что отклонения в последовательности аминокислотных остатков, которые не соответствовали бы окончательной реконструкции, никогда не обнаруживались. Например, Сэнджер, изучая строение инсулина, исследовал огромное число пептидных фрагментов, причем они, без единого исключения, соответствовали той последовательности остатков в двух цепях, которая была установлена в конечном счете при полной реконструкции. Подобные исследования убедительно говорят в пользу однородности исходного материала в отношении расположения аминокислотных остатков. В других работах, например в исследованиях Шеферда и его сотрудников, посвященных структуре АКТГ, и в тщательном хроматографическом разделении фрагментов рибонуклеазы, полученных при ферментативном расщеплении, тщательно определяли выход всех фрагментов, и количественные данные, полученные для многих участков общей последовательности аминокислотных остатков, оказались лежащими в пределах статистически допустимых ошибок эксперимента.
При анализе АКТГ каждый фрагмент был выделен с выходом не менее 70%, а общий их выход составлял в среднем около 93% исходного материала. В тех случаях, когда выход фрагментов был столь незначителен, что количественное изучение их было невозможным, удалось показать при помощи бумажной хроматографии, анализа концевых аминокислот, а также на основе общего молярного отношения аминокислот, входящих в состав белка, что однородность в смысле последовательности аминокислотных остатков весьма вероятна.
Эти примеры иллюстрируют два возможных пути оценки гомогенности белка: во-первых, путем установления соответствия между последовательностью в мелких пептидных фрагментах и последовательности в полипептидной цепи, полученной после окончательной реконструкции; во-вторых, определяя степень полноты выявления этих фрагментов. Точность результатов, полученных этими двумя путями, зависит от точности применяемых методов выявления и анализа пептидов; при этом можно установить нижний предел степени однородности. Согласно этим критериям, большая часть изученных белков и полипептидов представляются однородными по крайней мере на 90% или более, если, не считать некоторых особых типов неоднородности, подробно обсуждаемых в дальнейшем. Характер остальных 5— 10% (или 3—5%, при тщательном анализе при помощи ионообменной хроматографии) неясен, и возможно, что в них заключено небольшое количество физически сходных, но структурно различных белков.
Второй, более трудный вопрос сводится к тому, чтобы установить, до какой степени близкородственные белки в процессе выделения удается отделить от главной фракции. Очистка такого белка, как гемоглобин, не связана с трудностями этого рода, поскольку исходный материал — промытые эритроциты — содержит лишь незначительные примеси других белков, и при тщательной постановке экспериментов можно выделить гемоглобин почти количественно. Однако большую часть ферментов или гормонов приходится концентрировать в сотни или даже тысячи раз при выделении в чистом виде из их исходного состояния in vivo. Современные методы очистки позволяют обнаружить необычайно тонкие различия. Весьма вероятно, что в условиях, в которых удается разделить две формы какого-либо белка, различающиеся лишь кислотной карбоксильной группой, очень слабые различия в заряде или полярности в пределах семейства могут привести к полному разделению родственных молекул.
Вследствие этого мы не можем категорически отрицать наличие микрогетерогенности даже в том смысле, в каком ее понимали Кольвин, Смит и Кук. Вместе с тем не существует и таких данных, которые заставляли бы принять точку зрения «широкого спектра», и поэтому в настоящее время нет нужды представлять себе биосинтез белка как нестрогий или произвольный процесс.
Тот факт, что в некоторых белках наблюдается совершенно определенная неоднородность, связанная с различной последовательностью аминокислотных остатков, можно объяснить иначе, с более оптимистической позиции. Изомерию, наблюдаемую для β-лактоглобулинов, гемоглобинов, гаптоглобинов сыворотки и т. п., можно считать отражением гетерозиготности соответствующего генетического материала. В тех случаях, когда был проведен достаточный генетический анализ, наличие двух или нескольких форм определенного белка удалось связать с присутствием наборов аллельных генов; в большинстве случаев таких форм было лишь две. Например, у любого данного индивидума можно обнаружить лишь один аномальный гемоглобин (если не считать варьирующих количеств гемоглобина плода, который, возможно, очень сходен с частью гемоглобина взрослого человека или идентичен ей). Вместе с тем некоторые другие белки иногда обнаруживались в нескольких различных формах. Например, белки β-глобулиновой фракции сыворотки крупного рогатого скота можно разделить чувствительным методом электрофореза в геле из крахмала на четыре или пять ясно выраженных субкомпонентов. Очень важно подчеркнуть, однако, что эти компоненты действительно разделяются и при этом получается очень четкая и воспроизводимая характерная картина, а не перекрывающие друг друга пятна. Некоторые методы, например постепенное осаждение высаливанием, дают возможность разделить на несколько компонентов даже высокоочищенный гемоглобин здоровых людей. Многие исследователи считают, что такое разделение представляет собой артефакт, вызванный взаимодействием с солями и молекулами буфера, однако не исключена возможность, что это истинное разделение, которое просто не удается продемонстрировать при обычном электрофоретическом анализе, применяемом для изучения гемоглобинов.
Мы уже упоминали о концепции тонких генетических структур, согласно которой каждый «ген» может состоять из большого числа химических субъединиц, причем каждая из этих субъединиц содержит небольшое количество информации, необходимой для процесса биосинтеза белка. Если эту концепцию считать общей, то она должна объяснять и наличие многочисленных ненормальных форм белка, помимо нормальной. Возможно, что та часть генетического материала, которая связана с синтезом определенной Молекулы белка, выходит за пределы одного цистрона. Возможно также, что синтез отдельных цепей или даже отдельных частей одной и той же цепи контролируется различными функциональными генетическими единицами. Если это так и если мутации окажутся не летальными и допустят синтез функционально-активного белка, то легко себе представить, что в результате совместного действия нескольких цистронов может возникнуть множество близкородственных белков. Выделенные и изученные до настоящего времени гемоглобины отличались друг от друга по электрическому заряду. Поскольку методом электрофореза различия между двумя гемоглобинами, связанные, например, с заменой изолейцина или серина на треонин, выявить не удается, то в этом случае для выявления подобной возможности следует применить другие методы фракционирования.