Цепное, неконтролируемое окисление липидов тормозится специальными агентами для того, чтобы в тканях проходило «нормальное» ферментативное ступенчатое окисление, снабжающее энергией весь организм.
Жиры организма обладают как бы иммунитетом против самоокисления — они насыщены антиоксидантами. К такому выводу приводит не только логика, но и прямой лабораторный анализ. В частности, это подтверждает такой опыт.
В окисляющуюся на воздухе олеиновую кислоту (в которой нет антиоксидантов) добавляли 1% тканевых жиров из любого органа человека. Окисление сразу же резко замедлялось. Особенно сильным антиокислительным действием обладают свободные липиды различных участков головного мозга.
А как обстоит дело со свечением? Как меняется оно в момент добавления тканевых жиров к олеиновой кислоте?
Измерения, проведенные с помощью фотоумножителей, показали, что в этот момент свечение резко увеличивается. Мы сталкиваемся здесь с явным противоречием. Если образование перекисей снижается, то почему усиливается люминесценция? Ведь раньше мы утверждали, что эти два процесса взаимосвязаны. Мы приводили аргументы в пользу этой связи. Теперь появился аргумент противоположный и прежняя точка зрения должна быть проверена снова.
Чтобы проверить это, провели следующий эксперимент. Анализировались образцы олеиновой кислоты, находящиеся в разных стадиях окисления. В одних случаях количество накопившихся перекисей было невелико, в других — значительно. Каждый раз к кислоте добавляли одно и то же количество тканевых липидов. Оказалось, что чем больше в олеиновой кислоте перекисей, тем сильнее свечение. Значит, мы снова убедились, что люминесценция происходит за счет перекисей или других продуктов окислительной реакции. Но какие еще продукты порождаются цепью окисления кроме перекисей? Есть ли смысл раздумывать о неких таинственных побочных продуктах, когда проще всего предположить, что свечение создается разложением перекисей. Это кажется наиболее логичным на первый взгляд, но, к сожалению, не укладывается в рамки установленных фактов.
Эксперименты показали, что при взаимодействии окисленной олеиновой кислоты с тканевыми липидами перекиси почти не разрушались. Их количество менялось совершенно незначительно. Этот неожиданный результат сразу же поставил три новые проблемы: откуда берется энергия для свечения, почему интенсивность свечения все же сильно возрастает с увеличением содержания перекисей, каким образом антиоксиданты тормозят автоокисление, если они очень медленно разрушают перекиси. Третья проблема связана не только с вопросами биолюминесценции, но с кардинальными свойствами живых организмов, с задачами медицины и фармакологии.
Посмотрим сначала, как антиоксиданты тормозят цепные реакции. Вот что установил по этому поводу академик Н. Н. Семенов.
Антиоксидант, который мы будем обозначать символом АН (имея в виду, что в его составе имеется водород; все остальное — это А), чаще всего взаимодействует с радикалом, несущим основную ответственность за развитие цепи
R’ + АН → RH + А’
ROO’ + АН → ROOH + А’
В результате образуется неактивный радикал антиоксиданта (А’) который уже не способен продолжать цепь. Активные центры цепной реакции выводятся из строя. Значит, некоторые антиоксиданты могут «губить» окисление не путем взаимодействия с перекисью, а гораздо эффективнее — поражают его в самом зародыше.
Но если антиоксидант взаимодействует не с самой олеиновой перекисью, а с ее предшественником, то почему свечение усиливается с увеличением количества перекиси? Рассмотрим снова схему цепных реакций
R’ + O2 → ROO’
ROO’ + RH → ROOH + R’
ROOH → RO’ + ‘ОН
RH + RO’ → ROH + R’ и т. д.
Из этой схемы видно, что значительная часть радикалов образуется или за счет диссоциации перекиси, или же за счет взаимодействия перекисных радикалов с веществом. Следовательно, не только количество перекиси зависит от количества радикалов R’, но и наоборот — концентрация радикалов стоит в прямой зависимости от концентрации перекиси. Это и дает нам ответ на второй вопрос.
Остался еще один вопрос, может быть, самый для нас важный. Какая реакция поставляет энергию для биолюминесценции?
В веществе, которое способно к цепному окислению, имеется много активных радикалов ROO’. Эти радикалы могут встретиться и между ними произойдет реакция. Как показал Р. Ф. Васильев, такая реакция дает большой выход люминесценции, ее уравнение можно представить следующим образом
ROO’ + ROO’ → Р* + Р + hυ
Такое взаимодействие («рекомбинация») активных радикалов является одним из источников энергии для биохемилюминесценции.
Как мы уже знаем, «гасящие» свойства антиоксиданта состоят в том, что молекула этого вещества подавляет активный (ответственный за развитие цепи) радикал, снабжая его оболочку недостающим парным электроном. Следует помнить, что в реакции участвуют только электрически нейтральные частицы. Можно еще сказать так: антиоксидант обезвреживает «опасный» радикал, становясь радикалом, но уже неопасным. Но тогда в окисляющемся веществе неизбежно будут находиться радикалы еще двух типов — ROO’ и А’. Естественно, что такие различные радикалы могут встретиться. Что при этом произойдет? Непарные электроны внешних оболочек объединятся и вместо двух радикалов образуется неактивная молекула
ROO’ + А’ → Pi’
Но радикальные реакции, как показал академик В. Н. Кондратьев, сопровождаются выделением большого количества энергии. Это и понятно: при объединении радикалов в неактивную молекулу происходит перестройка электронов из энергетически невыгодного (с большой потенциальной энергией) в энергетически выгодное состояние. Точнее говоря, молекула, возникающая при соединении радикалов, получается перевозбужденной, и излишек энергии затем уносится прочь квантом света, фотоном.
По мере расходования активных радикалов свечение ослабляется и вспышки прекращаются.
Нет ничего невозможного в том, что излучение света окисляющейся олеиновой кислотой отчасти происходит и за счет другого химического процесса, пока нам неизвестного. Но вероятнее всего основная доля люминесценции в этом случае является результатом соединений радикалов. Такая гипотеза привлекательна тем, что она объясняет и другие наблюдаемые свойства окисления.
Итак, свечение жира стало ключом к расшифровке важнейших явлений живого организма — механизма подавления окисления липидов в тканях. Слабые фотоны, едва уловимые с помощью мощных приборов, поведали о чудесных особенностях биоантиоксидантов, рассказали, как эти необходимые организму вещества действуют. Только ли об этом может рассказать биолюминесценция?
Если свечение окисляющего липида является следствием радикальной реакции, то любой фактор, способствующий образованию радикалов, должен усиливать свечение. Это относится как к экстрагированному из ткани липиду, так и к жиру, находящемуся внутри организма. Значит, при воздействии на животных таким агентом, который способствует появлению радикалов в тканях, сверхслабая биолюминесценция возрастает.
Советский ученый профессор Б. Н. Тарусов показал, что одним из наиболее сильных факторов, приводящих к развитию цепных реакций и накоплению свободных радикалов в организме, является ионизирующее излучение. Он установил, что гибель живых организмов при облучении происходит в значительной степени из-за развития в тканях цепных реакций, вызванных радикалами. Сотрудники Б. Н. Тарусова — А. И. Поливода и Е. Н. Секамова — провели измерения уровня биолюминесценции подвергнутых ионизирующему облучению животных. Оказалось, что свечение тканей этих животных в видимой области спектра действительно усилилось. Так было получено еще одно подтверждение упомянутой выше гипотезы.
Следующее подтверждение можно искать не с помощью увеличения количества радикалов, а посредством уменьшения количества перекиси. Если гипотеза верна, то свечение не должно ослабевать.
Делались и такие опыты. Олеиновую кислоту помещали в запаянную ампулу, из которой выкачивали воздух, и долго нагревали ее при температуре 50—60° С. При такой термической обработке перекиси разрушаются через 6—8 суток. После того, как перекиси заведомо распались, ампула была вскрыта. В этот момент ФЭУ зафиксировали сильное свечение, явившееся результатом проникновения кислорода в ампулу. Свечение не могло происходить из-за распада перекисей: ведь этих соединений в ампуле не было.
Представим на минуту, что удалось окончательно доказать, что сверхслабая люминесценция органических веществ есть следствие только радикальных реакций. Какой мощный инструмент исследования внутритканевых процессов появился бы в руках ученых! Ведь радикалы, по современным воззрениям, играют колоссальную роль во всех химических преобразованиях, они образуются при большинстве реакций и ответственны за протекание и развитие этих реакций. Повсюду, где взаимодействуют молекулы, присутствуют активные побудители химических процессов — радикалы. Узнать, сколько в веществе радикалов — значит узнать тайну реакции. Но коль скоро радикалы дают свечение (это побочное явление, следствие случайного слияния двух встретившихся радикалов), то с помощью разработанной методики, использующей ФЭУ, можно как бы заглядывать в самое «горнило» реакции и видеть невидимое.
Желаемое доказательство пока не получено. Скорее всего, люминесценцию большинства соединений органического происхождения нужно рассматривать как результат наложения нескольких параллельно протекающих процессов. Однако по спектру излучения можно, в принципе, установить вклады этих процессов и, следовательно, с помощью ФЭУ анализировать сложное явление, расчленяя его на сумму более простых. Большое значение имело бы усовершенствование способов регистрации фотонов и установления их спектральной принадлежности.
Особенно важно распутать клубок вопросов по отдельным ниточкам в случае живого организма. Выше мы довольно подробно рассказали об исследовании люминесценции липидов. Речь шла только о липидах. А в теле любого живого существа — огромное количество различных соединений. Тут уже заведомо можно сказать, что люминесценцию вызывают не только радикальные реакции, но и другие процессы. Некоторые из этих процессов обсуждались и обсуждаются специалистами. Кое-что начало постепенно проясняться, хотя главные открытия по-прежнему ждут ученых завтрашнего дня. Чтобы читатель хоть отчасти имел представление, какие реакции возможно участвуют в продуцировании биолюминесценции (кроме уже описанной радикальной реакции), мы приведем несколько наиболее вероятных схем.
Прежде всего несколько слов о балансе энергии. Дело в том, что мы не можем строить какие угодно предположения о механизме живого свечения, ибо находимся в жестких рамках закона сохранения энергии. Видимая люминесценция несет значительную энергию (в расчете на один акт испускания), поэтому поставщиком этой энергии может быть далеко не всякая реакция.
Помимо радикальной реакции к образованию перевозбужденных молекул приводит разрушение перекисного мостика —О—О—. Так как дальнейший переход молекулы на основной энергетический уровень сопровождается высвечиванием фотона, то для нас представляет интерес более подробное рассмотрение процесса.
Разрушение мостика лучше всего изучено для соединения, называемого триаминофтальгидразидом. Вот схематическая формула его «ядра».
Так как сейчас нам не нужно знать всю структуру соединения, то на схеме изображены лишь те атомы, которые принимают участие в реакции, вся «лишняя» часть молекулы не изображена.
Триаминофтальгидразид подвергался в лаборатории окислению посредством добавления к нему перекиси водорода Н2О2. Французский исследователь Дру предложил следующую последовательность реакций, приводящих к люминесценции.
Гипотеза Дру заключается в следующем: происходит последовательное воздействие на молекулу триаминфтальгидразида двух молекул перекиси водорода. В первом акте взаимодействия образуется перекисный мостик —О—О—, но свечения еще не возникает. Присоединение второй молекулы перекиси вызывает разрушение мостика, что в свою очередь приводит в некоторых случаях к высвечиванию, т. е. к освобождению лишней энергии в виде фотона. Если же рассматривать лишь начало и конец процесса, то можно сказать, что все сводится к разложению двух молекул перекиси водорода на воду и молекулярный кислород.
У этой схемы есть одно довольно слабое место. Известно, что разложение двух молекул перекиси водорода сопровождается выделением всего 50 ккал/моль. Фотоны же, регистрируемые при этой реакции, соответствуют процессу, освобождающему 60—70 ккал/моль. Разница не так уж велика, но, тем не менее, как быть с законом сохранения энергии, который не допускает даже малейшего отступления? По этому поводу были высказаны предположения, что в реакции участвуют не две, а большее количество молекул перекиси. Вопрос, однако, остается пока неясным. И все же участие перекисных мостиков в процессах хемилюминесценции установлено настолько твердо, что приведенная схема является сейчас одной из общепринятых.
Однако в 1961 г. американский ученый Вайт, анализируя экспериментальные данные, разработал новую схему окисления люминола в водных растворах. Как и прежде, ограничиваясь лишь нужной частью молекулы, можно написать реакцию Вайта через такую последовательность взаимодействий. Символом R’ здесь обозначен радикал перекиси водорода, который гасится за счет образования радикала люминола. Перекисный радикал появляется в результате воздействия на перекись металлов переменной валентности. Следовательно, схема Вайта учитывает роль металлосодержащих катализаторов, значение среды. Но в то же время схема эта не доработана, она предполагает наличие целого ряда неизвестных промежуточных ступеней. Поэтому против нее можно найти веские возражения. Но дискуссии — обычное явление в таком сложном вопросе, каковым является биолюминесценция.