Определенный интерес представляют опыты Вуда и сотрудников по замораживанию клеток Saccharomyces cerevisiae (гаплоидный штамм).
Когда взвеси с фосфатным буфером охлаждали, они обычно замерзали при температуре —0,5°, но их можно было переохладить даже до —10°. Хранение этих взвесей в интервале указанных температур в течение нескольких часов не наносило клеткам никаких повреждений. В замороженной взвеси 90—100% клеток переживало хранение в течение 60 мин при температуре от —0,5 до —10°. Когда же температура охлаждения была ниже —10°, происходили явные повреждения клеток. Во взвесях, выдерживавшихся в течение 60 мин при температуре —30°, только 60% клеток сохраняли жизнеспособность.
Влияние рентгеновских лучей на дрожжевые клетки испытывали при различных температурах. При этом не отмечали никаких различий в чувствительности клеток при температуре от +40° до 0° или в переохлажденных смесях при любой температуре ниже —10°. Наоборот, чувствительность к облучению клеток, замороженных при —10°, была снижена наполовину. Вместе с тем клетки, замороженные до —10° и затем согретые, обладали обычной чувствительностью к облучению при 0°. Следовательно, процесс замораживания до —10° и оттаивания не вносил изменений в их структуры. Чувствительность к облучению снижалась еще на 25% при понижении температуры от —10 до —30°. Однако в интервале от —30 до —72° наблюдалось поразительное повышение чувствительности к облучению. Быстро охлажденные до —72° клетки оказались не более устойчивыми к данной дозе рентгеновских лучей, чем клетки, находящиеся в жидкой фазе при 0°. При этом во всех опытах была принята поправка на число клеток, погибших во время замораживания и оттаивания. Например, около 20% клеток переживало быстрое охлаждение до —50° и около 15% — охлаждение до —72° и последующее оттаивание. В пробах, подвергавшихся в течение 1, 5, 20 и 60 мин воздействию низкой температуры, выживал одинаковый процент клеток. Выживаемость значительно возрастала, когда пробы медленно охлаждали до —72°, выдерживая их по 5 мин при температурах —10, —22, —33 и —50°.
В обработанных подобным образом пробах после оттаивания был такой же высокий процент жизнеспособных клеток, как и в пробах, которые подвергали замораживанию в пределах от —22 до —33° и последующему оттаиванию. Чувствительность к рентгеновским лучам у дрожжей, медленно охлажденных до —72° и затем облученных при этой же температуре, была значительно ниже, чем у быстро охлажденных до —72° дрожжей, и примерно такого же порядка, как при охлаждении и облучении дрожжей при температурах от —20 до —30°.
Интересно отметить, что дрожжи, быстро охлажденные до —72°, а затем согретые и вновь охлажденные до —10°, были так же чувствительны к облучению (с жидкой и в твердой фазах), как и культуры, первоначально охлажденные до —10° и облученные при этой температуре. В то же время дрожжи, которые быстро охладили до —72°, слегка согрели и облучили при —50 или —33°, были менее устойчивы к облучению, чем клетки, которые сразу были охлаждены и облучены при этих температурах.
Повышенную устойчивость замороженных клеток к рентгеновским лучам объясняли тем, что токсические продукты облучения в известной степени теряют способность диффундировать в цитоплазму и инактивировать наиболее чувствительные или жизненно важные компоненты клеток. Можно было бы предполагать, что по мере уменьшения температуры будет снижаться и скорость диффузии, а одновременно с этим будет ослабевать и губительное действие рентгеновских лучей. Результаты, полученные Вудом и Тейлором, не подтвердили этого предположения, в связи с чем возникла необходимость исследовать влияние замораживания на дрожжевые клетки при разных скоростях охлаждения и различных конечных температурах. Было установлено количество воды, замерзшей во взвесях дрожжей при разной температуре. Количество тепла, необходимое для оттаивания проб, охлажденных до различных температур, определяли с помощью микрокалориметрических методов. Было выявлено соотношение клеточной массы к общей массе взвеси. Оказалось, что содержание воды в клетках составляло 69%. Кроме того, были найдены величины удельной теплоемкости калориметра и остатка сухого вещества клеток и выведена формула расчета замерзшей части нормальной дрожжевой клетки при различной температуре. Показано, что доля клеточной воды, превращенной в лед, как и следовало ожидать, увеличивалась по мере понижения температуры, при которой замораживали дрожжи от —0,5 до —22°. При —22° кристаллизовалось до 91 % воды. При температуре ниже —22° количество вымерзшей из клетки воды неожиданно уменьшалось и продолжало постепенно уменьшаться по мере понижения температуры. При —72°, по-видимому, вымерзло только 74% клеточной воды. Вуд и Розенберг пришли к выводу, что часть воды в цитоплазме, скорее всего, была «связана» и не могла вымерзать. Вряд ли количество связанной воды
могло увеличиваться в процессе замораживания при температурах ниже —22°. В то же время весьма вероятно, что удельная теплоемкость изменяется по мере понижения температуры. Сделав соответствующую поправку, Вуд и Розенберг получили вторую кривую, в которой рассчитанное количество замороженной клеточной воды оставалось всегда постоянным на уровне 94% в интервале температур от —22 до —72°. Несмотря на такой большой объем вымерзшей воды (94%), дрожжевые клетки переживали охлаждение до —22°. Ясно, что внутри самой клетки не всегда имело место вымерзание воды.
Меримэп и Платт в опытах по замораживанию печени млекопитающих в зависимости от скорости продвижения границы между льдом и водой определяли, вымерзала ли вода внутри цитоплазмы или же снаружи клеточной оболочки. При небольшой скорости замерзания (менее 1,5 мм/мин) повышение осмотического давления вне клетки в связи с замораживанием среды влекло за собой дальнейшее выделение воды через оболочку. В результате клетки обезвоживались и вода вымерзала из цитоплазмы снаружи клеточной оболочки. При быстром замораживании клеток печени (более 1,5 мм/мин) внутриклеточное замораживание наступало до обезвоживания клеток в результате повышения осмотического давления окружающей среды. Когда быстрому замораживанию при —72° подвергали дрожжевые клетки, скорость продвижения границы, отделяющей лед от воды, составляла приблизительно 7 мм/мин. Следовательно, если дрожжевые клетки по своим реакциям не отличались от клеток печени, то и в них замораживание должно было бы происходить внутри клеток. При замораживании взвесей дрожжей при —33° граница, отделяющая лед от воды, перемещалась со скоростью 1,5 мм/мин, а при более высоких температурах — еще медленнее. Вода цитоплазмы могла выделяться через оболочки отдельных клеток и замерзать во внеклеточных пространствах. Эти теоретические выводы совпадали с опытными данными Нея, который охлаждал под микроскопом взвеси дрожжей с различной скоростью и наблюдал процесс образования льда. При быстром замораживании при температуре от —2 до —10° происходила внеклеточная кристаллизация льда, и клетки постепенно сжимались. При быстром замораживании при —78 и —190° кристаллы льда появлялись и внутри клеток. Разной локализацией кристаллов льда можно объяснить неодинаковую чувствительность дрожжевых клеток, охлажденных до различных температур, к рентгеновским лучам.
При действии ионизирующего излучения в замороженных клетках возникают свободные радикалы в равных количествах на каждую единицу объема воды, независимо от того, находится ли она в жидком состоянии или в замерзшем, внутри или вне клетки. Если эти свободные радикалы и их продукты образовались во льду, они, вероятно, будут фиксироваться в месте своего возникновения и смогут лишь постепенно, очень медленно диффундировать оттуда. При вымерзании большого объема воды вне клеток фиксированные во внеклеточных пространствах свободные радикалы, высвобождаясь при оттаивании, будут растворяться во внешней среде и не смогут причинить вреда уязвимым и жизненно важным частям клеток. Вуд и. сотрудники полагают, что уменьшение чувствительности дрожжевых клеток к облучению при температурах от 0 до —30° обусловлено тем, что по мере понижения температуры увеличивается объем воды, вымерзающей вне клеток. Подобно этому клетки, медленно охлаждаемые до —72°, обезвоживаются в процессе медленного замораживания, чем и объясняется их низкая чувствительность к облучению.
В то же время при быстром охлаждении до температур ниже —30° какая-то часть воды в цитоплазме вымерзает внутри самих клеток. Объем внутриклеточного льда зависит от температуры замораживания. При температуре —72° вся клеточная вода может быть заморожена in situ. Во время облучения свободные радикалы фиксируются внутри клеток и после оттаивания могут нанести повреждение жизненно важным и уязвимым частям клеток. Этим, по-видимому, можно объяснить тот факт, почему дрожжевые клетки, быстро охлажденные до —72° и облученные при этой температуре, были так же чувствительны к рентгеновским лучам, как и клетки, облученные в жидкой фазе или при температуре, близкой к 0°.
Поскольку такие клетки, как кишечная палочка, по своему размеру значительно меньше дрожжей и отношение их поверхности к объему больше, вода из них быстрее диффундирует через оболочку клетки во внеклеточные пространства. Клеточные оболочки бактерий, кроме того, более хрупкие и лучше пропускают воду, чем оболочки дрожжей. При быстром охлаждении кишечной палочки до температур ниже —30° ее чувствительность к облучению не повышается. Согласно Вуду и Тейлору, это объясняется тем, что маленькие клетки быстро обезвоживаются и, следовательно, в них не образуются кристаллы льда даже при таких скоростях охлаждения, которые обычно влекут за собой внутриклеточное вымерзание воды в дрожжевых клетках и в клетках печени кролика.