Точный диагноз причин повреждений, вызванных предположительно нематодами, требует, помимо учета находящихся в тканях растений эндопаразитов, также знания видового состава почвообитающих нематод, особенно эктопаразитических, а также инфекционного потенциала цистообразующих нематод.
Методы обнаружения почвообитающих нематод основываются или на их активности, способности к передвижению и размере, или на плотности их популяций.
Чашки Остенбринка. В данном случае исследования проводятся так же, как при работах с растительным материалом. Слой почвы толщиной 5 мм осторожно распределяют на ватном фильтре. Если из образцов легкой и средней почвы нематоды высвобождаются в основном за три дня, то время исследования тяжелых или богатых гумусом почв удлиняется до 5—6 дней, причем через три дня нужно сменить воду. С помощью этого метода можно обнаружить все виды свободноживущих активных нематод (Aphelenchus, Aphelenchoides, Globodera, Heterodera, Ditylenchus, Par atylenchus, Pratylenchus, Trichodorus, Tylenchorhynchus, Rotylenchus, Helicotylenchus, нематоды-сапрофиты). Ошибка опыта в пределах 10—30% должна приниматься во внимание при подведении итогов.
Модифицированный вороночный метод Деккера. И в этом случае методика исследований соответствует применяемой для обнаружения нематод в растительном материале. На ватный фильтр осторожно наносят тонкий (5 мм) слой почвы. В течение 2—3 дней из образцов легких и средних почв выходит большинство активных нематод, для богатых гумусом и тяжелых почв период исследования следует удлинить до 4—6 дней, через три дня сменив воду в воронке. Выделенных нематод можно содержать в холодильнике до окончательного определения. Ватный фильтр и почвенный субстрат необходимо постоянно хорошо увлажнять (компенсация потери от испарения!). В соответствии с размером воронок объемы проб почвы могут колебаться от 10 до 20 мл.
Метод Деккера позволяет обнаружить всех живущих в почве активных нематод, причем точность обнаружения в зависимости от вида может составлять 75±15%.
Примечание. Чтобы нематоды были хорошо обеспечены кислородом, нужно избегать переувлажнения исследуемой почвы.
Метод декантирования на ситах. В специальной литературе описано несколько методик этого рода. Они были модифицированы, уточнены и применяются в зависимости от величины популяции и активности выявляемых видов нематод.
Непросеянный или пропущенный через крупное сито (1 мм) образец почвы массой 200—400 г вместе с 8—10-кратным количеством воды помещают в сосуд и интенсивно перемешивают. Через 10—20 секунд после оседания грубых частиц почвы остаток пропускают через набор сит соответствующих размеров: для мелких нематод родов Meloidogyne, Heterodera, Pratylenchus, личинок Xiphinema и Trichodorus — 1 мм, 200 мкм и 30 мкм; для удлиненных нематод родов Longidorus и Xiphinema — 1 мм и 90 мкм. Этапы 1—4 повторяют три раза. Остаток на грубом сите выбрасывают, остаток с тонкой сетки смывают легкой струей воды из пульверизатора и переносят в химический стакан. После отстаивания в течение 15—30 мин большую часть поверхностного слоя можно слить. Оставшуюся суспензию нематод переносят на счетное стекло и после короткого отстаивания используют для исследований.
При высоком содержании тонкого песка или частиц органического вещества суспензию нематод рекомендуется процедить через ватный фильтр и по аналогии с модифицированным вороночным методом провести дополнительное отделение нематод от взвешенных примесей. В данном случае химический стакан можно плотно закрыть ватным фильтром и марлей, перевернуть и установить на воронку. Выход нематод заканчивается через 12—24 ч.
Примечание. Используя систему сит, следует помнить, что только хорошо увлажненное и наклонно поставленное тонкое сито обеспечивает равномерное протекание суспензии. Кроме того, при смыве нужно использовать как можно меньше воды, чтобы избежать потери мелких нематод.
Недостатки метода — относительно высокие затраты труда, а также возможность субъективных методических ошибок при его проведении — уравновешиваются его преимуществами: 1) в относительно короткий срок можно исследовать и обработать большие количества почвы; 2) при использовании незначительного количества материала можно выявлять как неактивные (осадок на тонкой сетке исследуется сразу), так и активные стадии нематод; 3) полученный материал (нематоды) пригоден для дальнейшего изучения.
Метод центрифугирования. Быстрое обнаружение свободноживущих в почве нематод достигается центрифугированием в градиентах плотности. Почвенные пробы смешивают с 8—10-кратным количеством воды при интенсивном перемешивании. После 10—20-секундного отстаивания (в зависимости от структуры почвы) осадок пропускают через два сита с отверстиями 50 и 35 мкм. Процесс разбавления и процеживания исходного материала повторяют три раза.
Остаток с обоих сит (органические частицы, тонкий песок, остатки корней, нематоды и т. д.) смывают в химический стакан, полученную суспензию переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 4 мин при 1800 g. При осторожном сливе надосадочной жидкости одновременно удаляются крупные частицы с краев стакана. Осадок в центрифужном стакане суспендируют с помощью вибромешалки в насыщенном растворе сахара (d= 1,18) и еще раз центрифугируют не более 2 мин при той же скорости. Раствор сахара процеживают через два сита с отверстиями 28 мкм, остаток с обоих сит осторожно смывают водой и переносят в химический стакан или на счетное стекло.
Примечание. Чтобы ослабить плазмолитическое действие раствора сахара, нематод следует выдерживать в нем только очень краткое время. Поэтому при центрифугировании в растворе сахара обрабатывают только один стакан, затем нематод сразу же переносят в чистую воду.
Этот метод, требующий значительного технического оснащения, позволяет быстро получать количественно и качественно точные результаты, а также обнаруживать активных и неактивных нематод, свободно живущих в почве. Кроме того, в осадке на тонком сите находятся более крупные яйца нематод и различные представители фауны ризосферы.