Каррель и сотр. около 50 лет назад первыми начали систематическое изучение влияния среды на клеточное деление и регенерацию в тканях высших животных.
Каррель разработал методику асептического взятия эксплантатов органов и методику оценки влияния внешних факторов и химического состава среды на интенсивность роста этих эксплантатов. Его количественный метод оказался весьма трудоемким и состоял в основном в сопоставлении скорости роста двух равных половин одной и той же культуры фибробластов куриного эмбриона; одна половина находилась в стандартных условиях, т. е. служила контролем, а другая была подопытной. Прежде всего было отмечено, что при регулярной смене среды культура омолаживается, о чем можно судить по интенсивности роста. В статье, озаглавленной «О длительном культивировании тканей вне организма», Каррель указывал, что многократное перенесение ткани в новую среду стимулирует ее рост. К сожалению, эти исследования обычно выполнялись на фибробластах, а не на паренхиматозных клетках, которые представляют больший интерес.
Далее Каррель и Барраус отмечали, что разбавление культуральной среды также стимулировало рост культуры. Эти наблюдения позволили предположить наличие в сыворотке какого-то ингибитора. В дальнейших работах этому ингибитору было уделено специальное внимание. В большой серии работ по изучению влияния состава среды на рост фибробластов in vitro Каррель и Эбелинг показали, что сыворотка 3-летнпх кур значительно быстрее снижает скорость пролиферации фибробластов, чем сыворотка 3-месячных цыплят. Далее эти авторы показали, что это различие связано с присутствием в сыворотке старых птиц какого-то ингибитора, а не с отсутствием в ней стимулятора. Этот вывод был сделан на том основании, что добавление сыворотки молодой птицы не снимает подавляющего действия сыворотки старых птиц. Эти же авторы в дальнейшем показали, что ингибитор появляется в сыворотке при нагревании ее в течение часа до 60°. При более высокой температуре этот ингибитор разрушается.
Следующая работа выявила существование в сыворотке двух антагонистически действующих факторов — стимулятора роста, который выпадает в осадок при пробулькивании через сыворотку CO2, и ингибитора, который остается при этом в растворе. Если смешать эти два фактора или если восстановить исходную концентрацию разведенной сыворотки, результат будет такой же, как при применении необработанной контрольной сыворотки.
Представляет интерес ряд данных, приведенных еще в одной работе тех же авторов. Было установлено, что скорость роста культуры ткани в среде, содержащей сыворотку 6-летних кур, относится к скорости роста той же культуры в среде с сывороткой годовалых кур, как 0,61: 1,0. После нагревания обеих сывороток до 65° их ингибирующая рост активность изменялась по-разному, так что отношение становилось равным 0,76 : 1,0. Скорость роста культуры в прогретой сыворотке молодых птиц составляла 62% от исходной, а в прогретой сыворотке старых — 84%.
Приведены данные, полученные при грубом фракционировании сывороток молодых (6 месяцев) и старых (4—5 лет) кур. Содержание холестерина снижалось с 225 мг/100 мл у 3-месячных кур до 143 мг/100 мл у кур в возрасте от 4 до 5 лет.
В 1926 г. Бекер и Каррель сообщили, что ингибиторами роста служили как белковые, так и липидные компоненты сыворотки. В последней работе представляет интерес упоминание о том, что удаление лецитина оказывает благотворное действие на частоту сокращений изолированного сердца. В свете недавно опубликованных данных о мощном подавляющем действии перекиси липидов (часть из них легко образуется в процессе самоокисления фосфолипидов) можно предположить, что открытые Каррелем ингибиторы роста образуются в результате прогоркания ненасыщенных липидов и что действие этих ингибиторов может сниматься антиоксидантами, входящими в состав белковых фракций. Многочисленные вопросы, возникшие в связи с работами Карреля, ждут своего решения. Можно надеяться, что этому будут способствовать современные методы культуры ткани.
В 1936 и 1937 гг. Симс и Стилмен сообщили о своих наблюдениях, касающихся влияния различных веществ на культуры фибробластов. Они показали, что в ткани аорты взрослых людей содержится ингибитор, подавляющий деление фибробластов, выделенных из той же аорты. Этот ингибитор выпадает в осадок под влиянием 50-процентного спирта с добавлением хлористого кальция. Его можно выделить путем последовательной обработки измельченной ткани аорты трипсином, 50-процентным спиртом (на холоду) и хлористым кальцием. Вместе с тем эти же исследователи показали, что трипсин стимулирует дальнейший рост старых культур фибробластов.
Были сделаны следующие наблюдения: отмывание культур после обработки трипсином усиливало стимулирующий эффект; сыворотка, обработанная протеолитическими ферментами, не давала такого эффекта; в плазме, хранившейся несколько дней (в холодильнике или при комнатной температуре), ингибитор не обнаруживался. На основании всех этих данных Симс и Стелмен пришли к выводу, что по периферии культуры фибробластов образуется как бы слой ингибитора, который н удаляется при действии трипсина. Симс и Стилмен также показали, что в сыворотке содержится ростстимулирующий фактор; пока не ясно, идентичен ли этот фактор стимулирующему фактору, о котором упоминали Каррель и Эбелинг, и вообще есть ли между ними какая-то связь. Фактор, описанный Симсом и Стилменом, характеризуется следующими свойствами: 1) он диализуется; 2) сохраняет свою активность при нагревании до 100° в течение 10 мин при pH 7; 3) при pH 2 и 12 нагревание до 100° разрушает его в течение 5 мин; 4) он выдерживает хранение в холодильнике в течение 10 мес.; 5) осаждается солями меди и кальция; 6) в электрическом поле движется к аноду. Этот фактор был обнаружен в моче. Не известно, идет ли речь об одном факторе или их несколько.
В последующей работе из сыворотки путем фракционирования было выделено 4 фактора — А, В, С и D. Фактор А, о котором только что шла речь, присутствует в ультрафильтрате сыворотки и стимулирует рост прозрачных, лишенных жира клеток. Фактор В получали из сыворотки, отделенной от сгустка после свертывания плазмы, путем обработки в течение двух суток раствором Тироде (pH 7,3) в атмосфере, содержащей 7% углекислоты. Третий фактор С получали из плазмы кур, хранившейся в течение 4 суток в холодильнике. Полученный преципитат вызывает гибель клеток, а альбумин, осажденный сульфатом аммония, — дегенерацию клеток культуры. Наконец, четвертый фактор — D, который представляет собой глобулин, осажденный из плазмы сульфатом аммония, повышает адгезивность клеток.
Как сообщается в другой работе, фактор В вызывает отложение жира в культуре ткани аорты. Ни Каррелю с сотрудниками, ни Симсу и Стилмену не удалось определить, какие компоненты ответственны за ингибиторное и стимулирующее действие. Хотя, по-видимому, главную роль здесь играют перечисленные выше основные компоненты, не исключена также активность примесей, содержащихся в небольшом количестве. Сейчас ощущается еще более настоятельная необходимость в систематическом исследовании оптимальных условий роста дифференцированных клеток млекопитающих в культуре, а также в изучении влияния различных высокоочищенных препаратов на рост и другие свойства этих клеток. Вскоре после исследований Симса и Стилмена опубликовал свои данные Медавар; он установил, что способность изолированного сердца курицы противостоять ингибиторному действию микробного фактора, выделенного Хитоном, зависит от возраста. Математическая обработка материала и необычная для этого автора неясность изложения не дают возможности решить, имеют ли эти данные какое-либо отношение к обсуждаемому здесь вопросу. Марголиаши др. показали, что вытяжка из свежего сердца взрослого стимулирует рост третьего пассажа фибробластов, взятых от 8-дйевного куриного эмбриона. Высушенный ацетоном экстракт также обладает способностью стимулировать рост. Диализ свежего или высушенного ацетоном экстракта сопровождается полной потерей активности. Если же диализат смешать с оставшейся фракцией, то активность восстанавливается почти целиком.
Заканчивая рассмотрение гуморальных факторов или факторов среды, способных влиять на рост клеток в культуре или in vivo, следует упомянуть о данных Вольфсона и его сотрудников, касающихся накопления перекисей липидов в регенерирующей печени крыс; эти авторы применили количественный ТБА-метод (ТБА — тиобарбитуровая кислота). В типичном опыте, например, в присутствии аскорбиновой кислоты, показатель ТБА составлял 0,42 единицы оптической плотности. Через 10 час после гепатэктомии он был равен 0,62; спустя 48 час после операции, когда митотическая активность достигла максимальной степени, этот показатель упал до 0,27, а через 6 дней он восстановился почти до нормы (0,57).
В отсутствие аскорбиновой кислоты соответствующие значения этого показателя составили: 0,21, 0,21; 0,11 и 0,24. Эти данные о низком содержании перекиси липидов в регенерирующей ткани позволяют приписать им роль ингибиторов клеточного деления; следовательно, удаление этих перекисей должно стимулировать клеточное деление. С таким представлением согласуются также данные Вильбура и Бернгейма, которые показали, что добавление перекисей липидов в ничтожно малых концентрациях быстро подавляет клеточное деление и что воздействие ультрафиолетовых и ионизирующих лучей в дозах, достаточных для остановки клеточного деления, сопровождается повышением содержания этих перекисей. Можно считать, что регуляция клеточного деления осуществляется при участии относительно простых обменных процессов (образование и разрушение перекисей под влиянием каталазы и пероксидазы соответственно), а также при участии антиоксидантов (производных токоферола) или веществ, содержащих сульфгидрильные группы.
Заканчивая обсуждение факторов, регулирующих клеточное деление, следует подчеркнуть, что устойчивое состояние, характерное для клеточной популяции взрослого организма, поддерживается благодаря равновесию между процессами отмирания и деления клеток. Мы касались здесь лишь возможных общих факторов, регулирующих рост и деление клеток. Не меньший интерес представляют факторы, регулирующие процесс отмирания клеток. Проблемы таноцитологии (учение о смерти клетки) еще, по-видимому, ждут своего разрешения.