Методы окрашивания применяют для выявления в растительных тканях нематод на всех стадиях развития, включая яйца, и одновременно для точной их локализации.
Определение нематод представляет большие трудности, как правило, оно возможно лишь на свежепрепарированных особях.
Окрашивание лактофенол-хлопковой синью или лактофенол-кислым фуксином. Окрашивание паразитирующих в корнях нематод лактофенол-хлопковой синью или лактофенол-кислым фуксином проводится преимущественно в ориентировочных исследованиях. Не полностью одревесневшие корни тщательно моют, подсушивают между двумя листами фильтровальной бумаги и погружают на 1—3 мин в кипящий раствор лактофенол-хлопковой сини (100 г фенола, 83 мл молочной кислоты, 100 мл дистиллированной воды, 160 мл глицерина, хлопковая синь). Продолжительность окрашивания зависит от состояния корней, концентрации красящего вещества (приблизительно 0,05—0,1%), а также от заданной интенсивности окраски. Затем корни промывают в воде и для осветления помещают в неокрашенный раствор фенола. Исследование корней, которые должны быть погружены в жидкость (лактофенол, вода), проводят под стереомикроскопом или микроскопом. Все стадии нематод приобретают интенсивный синий цвет, в то время как ткани растений, за исключением частично окрашивающейся меристемы корня, поглощают незначительное количество красящего вещества. Использование кислого фуксина обеспечивает интентивное красное окрашивание.
Этот простой метод быстро дает результаты, но более длительное (свыше 3 мин) тепловое воздействие может привести к морфологическим изменениям у нематод; кроме того, особи, лежащие глубоко в тканях, распознаются слабо. Для одревесневших или мощно развитых корней (диаметр более 1 мм) данный способ окрашивания непригоден.
Методы окрашивания применяют для обнаружения в корнях эндопаразитических нематод, например видов Meloidogyne, Globodera, Heterodera и Pratylenchus.
Примечание. В кипящий раствор лактофенола можно погружать только корни, хорошо обсушенные между двумя листами фильтровальной бумаги. Необсушенный материал дает брызги при погружении (носить защитную одежду!).
Окрашивание раствором Флемминга. Тщательно вымытые неодревесневшие корни растений погружают на 2—3 мин в нагретую до 70—80 °С воду для умерщвления нематод и затем окрашивают раствором Флемминга (15 частей 1%-ной хромовой кислоты, 4 части 2%-ной осмиевой кислоты), в котором корни находятся 5—15 мин. Окраска тканей корней не изменяется, в то время как нематоды приобретают густой черный цвет. Процесс окрашивания можно наблюдать под стереомикроскопом. Окраска заканчивается многочасовым промыванием материала в проточной воде. Этот метод, разработанный Годфри, из-за сильной токсичности и высокой стоимости осмиевой кислоты применяется лишь в тех случаях, когда необходимо точно определить эндоиаразитических корневых нематод или получить резкие контрасты для фотосъемок.
Примечание. При работе с осмиевой кислотой (пары!) нужно носить защитные очки и защитную одежду. Ампулы с кристаллами осмиевой кислоты можно открывать только под водой.
Окрашивание бромфенолом синим. Одревесневшие и отмытые корни помещают на 4 ч в 0,5— 1%-ный раствор NaOCl, ополаскивают проточной водой и погружают на 5—10 мин в 50%-ный спирт. Затем их обсушивают между двумя листами фильтровальной бумаги и окрашивают в растворе бромфенола синего или бромтимола синего. Сильную, контрастную окраску дает 1%-ный раствор красителя в 50%-ном спирте при продолжительности окрашивания до четырех часов. Применение более слабых концентраций красящего вещества (0,05—0,1% в 50%-ном спирте) при соответственном удлинении времени окрашивания до 12—16 ч сопровождается менее контрастным окрашиванием, но большим деталированием. Личинки и яйца, окрашенные в цвета от зеленого до темно-синего, хорошо видны на фоне неокрашенных тканей растения. До исследования материал хранят в 50%-ном спирте, подкисленном уксусной кислотой.
Окрашивание бромфенолом синим позволяет выявлять в корнях все эндо — и семиэндопаразитические корневые нематоды на любой стадии развития.
Окрашивание смесью пикриновой кислоты и анилинового синего. Этот метод, описанный Якобом и Штемердингом, пригоден для окраски срезов одревесневших корней. Тщательно промытые кусочки корней фиксируют 48 ч в смеси спирта (50%), формалина (40%) и ледяной уксусной кислоты (соотношение 10:1:1). Обмыв материал в проточной воде, его разрезают на тонкие ломтики или полоски и еще раз промывают водой в течение 2 ч. Затем срезы выдерживают 1—2 мин в 1%-ном растворе сафранина, быстро ополаскивают водой и окрашивают смесью пикриновой кислоты и анилинового синего (100 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты+25 мл насыщенного водного раствора анилинового синего), постепенно доводя ее до точки кипения. Завершается процесс промыванием водой.
В красновато-желтой ткани корня отчетливо выделяются окрашенные в синий цвет нематоды и их яйца. Преимущество этого метода заключается в возможности окрашивать срезы одревесневших корней диаметром до 10 мм; результаты исследований получают через три дня.
Область применения описанных методов окрашивания ограничена преимущественно эндопаразитическими корневыми нематодами (например, видами Pratylenchus, поражающими плодовые и декоративные древесные культуры).