Биосинтез окситетрациклина проводят на средах, существенно не отличающихся по составу от используемых для получения других тетрациклиновых антибиотиков.
По времени процесс биосинтеза окситетрациклина более продолжителен, чем хлортетрациклина и тетрациклина. Максимум содержания окситетрациклина в среде приходится на 5—6-е сутки. За это время образуется две генерации мицелия. Членистый мицелий первой генерации после 24 ч развития распадается на короткие обрывки, которые, прорастая, дают начало гифам второй генерации. Членистые гифы могут прорастать и не распадаясь. Образующийся при этом мицелий состоит из тонких прямых гиф. К 72 ч прорастание члеников в основном заканчивается. Гифы второй генерации составляют основную массу мицелия до конца развития. Антибиотик синтезируется гифами второй генерации. Этот вторичный мицелий вырастает в иных условиях среды, чем первичный.
Биохимические изменения в процессе ферментации при биосинтезе окситетрациклина на синтетической среде. Интенсивный рост мицелия Act. rimosus продолжается в течение 48 ч, причем уже к 24 ч сухой вес мицелия достигает в среднем 50% от максимального. В дальнейшем вес мицелия существенно не меняется. Быстрому росту продуцента в первые часы ферментации соответствует и быстрое потребление основных компонентов среды, в частности азота, углеводов и минерального фосфора. К 24 ч из среды полностью исчезает неорганический фосфор, потребляется около половины первоначально содержащегося азота и значительная часть углеводов. В дальнейшем скорость потребления азота, а также углеводов снижается. Что касается минеральных соединений фосфора, то на протяжении всего дальнейшего периода ферментации последний в среде отсутствует. Рост продуцента и потребление питательных веществ сопровождается вначале небольшим снижением pH культуральной жидкости. От исходного значения, равного 6,9—7,0, к 16—24 ч pH понижается до 6,3—6,6. В дальнейшем наблюдается незначительное повышение pH до 7,1—7,3.
Таким образом, развитие вторичного мицелия происходит в условиях, когда в среде присутствует еще достаточно углеводов и азота, но полностью исчерпан неорганический фосфор.
Образование окситетрациклина практически начинается после 24 ч ферментации. К 60—70 ч накапливается около половины максимального количества антибиотика; максимальная активность достигается к 116—120 ч. Мицелий различных возрастов различается по интенсивности синтеза антибиотика. Она наиболее низкая в первые шестнадцать часов, резко возрастает между 24—48 ч и держится на высоком уровне до 70 ч, затем, по мере старения культуры, снова снижается.
Как известно, для биосинтеза антибиотика решающее значение имеют концентрации компонентов питательной среды. От их концентрации и соотношения может удлиняться или сокращаться вторая (продуктивная) фаза. Применительно к биосинтезу антибиотиков целесообразно, возможно, сократить первую фазу и увеличить вторую. При введении в среду различных концентраций крахмала (от 1 до 4%) течение ферментации оказывается различным. При однопроцентной концентрации крахмала последний почти полностью используется к концу первых суток. К этому времени накапливается значительная биомасса, однако уже на вторые сутки начинается автолиз вторичного мицелия из-за недостатка углеводов. По мере повышения концентрации крахмала он более длительное время сохраняется в среде. При этом ускоряется рост, увеличивается биомасса и количество образующегося антибиотика. При четырехпроцентной концентрации крахмала значительное количество углевода остается к концу ферментации неиспользованным. При использовании сред с низким содержанием углеводов можно получить высокие выходы антибиотика путем добавления глюкозы в период перехода мицелия из первой во вторую фазу.
Аммонийный азот оказывает влияние лишь на накопление биомассы. Вне зависимости от его концентрации продуктивность мицелия остается без изменения. Поэтому увеличение выхода антибиотика при изменении концентрации аммонийного азота может быть связано только лишь с большим количеством мицелия.
Концентрация фосфора в среде, как уже отмечалось выше, очень влияет на биосинтез тетрациклиновых антибиотиков. При изменении концентрации фосфора в среде происходит резкий сдвиг в обмене веществ продуцента. Об этом можно судить по некоторым продуктам метаболизма, присутствующим в культуральной жидкости. Синтетическая среда содержала, кроме крахмала и глюкозы, янтарную кислоту. При избытке фосфора ускоряется рост продуцента и накапливается большая биомасса. Более энергичному росту соответствует и более быстрое потребление углеводов и азота, более быстрое использование янтарной кислоты. Что касается продуктов метаболизма, то на среде с избытком фосфора накапливается больше летучих органических кислот, главным образом уксусной, и увеличивается содержание пировиноградной кислоты. Большему накоплению кислот на среде с избытком фосфора соответствует и более низкое значение pH по ходу ферментации.
На среде с избытком фосфора образование окситетрациклина снижается в 5—6 раз, продуктивность мицелия в этом случае очень низкая (не превышает 1 мкг/мг в час) и почти не меняется по ходу ферментации, тогда как на среде с 5 мг% фосфора продуктивность мицелия после 24 ч возрастает (6,0—6,8 мкг/мг в час) и в течение всей второй фазы ферментации держится на значительном уровне (4,8—2,9 мкг/мг в час).
Состав среды, в которой происходит рост вторичного мицелия, резко отличается от исходной, в частности в ней присутствуют только следы неорганического фосфора. Это обстоятельство дает основания предполагать, что вторичные гифы качественно отличны от первичных. Отличия должны касаться различных компонентов клетки, в частности фосфорсодержащих органических соединений. На синтетической среде с оптимальным в условиях опыта количеством фосфора (5 мг%) содержание общего фосфора в мицелии по ходу развития продуцента уменьшается, особенно резкое снижение имеет место в период перехода его во вторую фазу (24—48 ч). В мицелии, выращенном на среде с избытком фосфора, максимум общего фосфора сдвинут на 24 ч (вместо 16 ч) и содержание общего фосфора в мицелии сравнительно мало меняется по ходу развития, все время оставаясь на высоком уровне (2,0%).
Количество фосфора в среде почти не влияет ни на уровень, ни на характер кривой содержания в мицелии кислоторастворимого фосфора. Эта фракция и в том, и в другом случае представлена в основном минеральным фосфором. На содержание кислотонерастворимой фракции количество неорганического фосфора среды оказывает заметное влияние.
Фосфор этой фракции представлен в основном фосфором нуклеиновых кислот.
Для оценки влияния каждого из перечисленных факторов (углеводы, азот, фосфор) обычно используется стандартная среда, в которой поочередно меняют концентрацию одного из компонентов. На биосинтез антибиотика оказывают влияние не только концентрации отдельных ингредиентов среды, но и их соотношение.
В тех условиях, в которых авторы проводили опыт, наиболее благоприятными для синтеза окситетрациклина условиями являются: содержание крахмала 5%, аммонийного азота 140 мг% и фосфора неорганических соединений 7,5 мг%. Эти величины в каждом частном случае должны быть откорректированы в зависимости от технологических условий процесса: состава среды, аэрации, перемешивания, количества посевного материала и т. д.