Используя описанную выше методику, Стюарт произвел искусственное оплодотворение пяти коров спермой, охлажденной до —79°.
Среда содержала в конечной концентрации 16% глицерина, 0,86% цитрата натрия и 40% (по объему) яичного желтка. Одна из коров, осемененная спермой, которую хранили 48 час при —79°, забеременела и родила нормального теленка. Подопытных коров содержали отдельно, и поэтому была исключена всякая возможность естественной случки или же оплодотворения незамороженной спермой.
Исследования, проведенные позднее в более широком масштабе, в племенном хозяйстве в Кэмбридже, показали, что присутствие 15% глицерина не снижает оплодотворяющей способности незамороженной спермы. В ранних опытах по консервации клеток в замороженном состоянии сперму охлаждали медленнее, чем мы рекомендуем сейчас, и температуру в течение многих часов постепенно понижали от +30 до —79°. В результате оттаявшие сперматозоиды были малоподвижными и ни одна из осемененных ими коров не забеременела. Тогда в методику были внесены некоторые изменения. В сперму добавляли равный объем цитратно-желточного разбавителя и охлаждали ее до +5° в течение более 4 час. Затем при этой же температуре добавляли равный объем нитратного буфера, содержавшего 20% глицерина.
Несколько проб неумышленно оставили на ночь при температуре +50. На следующее утро в пробах спермы (содержащих 10% глицерина), находившихся в течение 20 час при температуре +5°, после согревания до +37° наблюдалась исключительно высокая активность сперматозоидов. Другие пробы охладили до —79° и затем согрели до температуры +37°. И в этом случае сперматозоиды сохранили необычную подвижность. Одной из таких проб осеменили корову, у которой искусственно вызвали овуляцию. Спустя 48 час корову забили и при вскрытии нашли в ее половых путях два дробящихся яйца.
Другие пробы спермы оставили при температуре +5° на 12—20 час для достижения равновесного состояния между сперматозоидами и глицерином, содержавшимся в разбавителе из яичного желтка. Затем пробы охладили и хранили при температуре —79° в течение различного времени от 2 час до 8 дней. Непосредственно перед использованием ампулы согрели, погружая их в воду с температурой +40°. Из 38 осемененных коров 30 забеременели и дали всего 27 телят, один из которых показан на фото 5. Мы организовали «банк» длительного хранения спермы при температуре —79° и разработали простое автоматическое приспособление для охлаждения ее до —79° со скоростью, оптимальной для последующего успешного восстановления ее оплодотворяющей способности. Обработанную описанным способом сперму хранили продолжительное время, а затем спустя различные промежутки времени ею осеменяли коров. Они показывают, что 75% коров, осемененных спермой, хранившейся в течение одного года при температуре —79°, забеременели.
На протяжении этого периода никаких признаков снижения оплодотворяющей способности спермы при удлинении срока хранения не наблюдалось. В пробах спермы той же партии, хранившихся в течение 4,5 лет при температуре —79°, отмечалось незначительное снижение оплодотворяющей способности: забеременели 66,7% осемененных коров. В ранних опытах пробы спермы содержали больше оплодотворяющих сперматозоидов, чем принято в обычной практике. Поэтому пробы спермы перед охлаждением до —79° разбавили в различной степени. Затем их после хранения в замороженном состоянии в течение 24 дней согрели и немедленно осуществили осеменение. Как показывают данные, оплодотворяющая способность спермы, которая до замораживания была разбавлена цитратно-желточной средой, содержащей глицерин, не снизилась даже при разбавлении в 40 и 100 раз.