Первые опыты показали большую активность сперматозоидов петуха в 20-процентных растворах глицерина при комнатной температуре или при температуре тела, но пробы спермы, содержащие более 2% глицерина, утрачивали оплодотворяющую способность.
Лишь очень немногие сперматозоиды переживали охлаждение до температуры ниже —79° при концентрации глицерина менее 5%. Тем не менее из 600 яиц, снесенных курами, которые были осеменены спермой, замороженной в присутствии 1—2% глицерина, вылупилось 3 нормальных цыпленка. Аналогично этому присутствие в растворе 10—20% этилен — или пропиленгликоля настолько подавляло оплодотворяющую способность незамороженной спермы петуха, что из 400 яиц, снесенных искусственно осемененными курами, только 3 оказались оплодотворенными— из двух яиц вылупились живые цыплята, а в одном был мертвый зародыш.
Описанные опыты натолкнули на мысль, что очень низкие температуры, возможно, не будут подавлять оплодотворяющую способность спермы, если удастся преодолеть вредное действие глицерина и родственных ему веществ при нормальной температуре. Примерно в это же время мы обнаружили, что в эритроцитах млекопитающих, взвешенных в среде, содержащей глицерин, и перенесенных в среду, лишенную глицерина, наступал гемолиз. Сперматозоиды петуха, чрезвычайно активные в 10- или 20-процентных растворах глицерина, полностью утрачивали подвижность при резком снижении концентрации глицерина в сперме. По-видимому, сперматозоиды становились неподвижными после искусственного введения их в половые пути также в результате резкого падения концентрации глицерина в окружающей среде. Глицерин можно было медленно удалить путем диализа, не повреждая эритроцитов или сперматозоидов петуха. Сперма петуха, разбавленная до концентрации глицерина 15% и инкубированная в течение 30—60 мин при температуре —79°, обладала нормальной оплодотворяющей способностью, если перед осеменением из нее путем диализа удаляли глицерин. К сожалению, потенциальная оплодотворяющая способность и подвижность сперматозоидов петуха, обработанных глицерином, постепенно снижались при хранении их в течение недель или месяцев при температуре —79°. Оплодотворяющая способность снижалась гораздо медленнее в пробах, хранившихся при температуре —190°. Из яиц, оплодотворенных сперматозоидами петуха, хранившимися в течение года при этой температуре, вылупились нормальные цыплята. Казалось невероятным, чтобы при температуре твердой углекислоты и жидкого воздуха в клетках происходили какие-то биохимические изменения. И тогда впервые возникло предположение, что физические процессы, происходящие в условиях низких температур, могут привести к старению и смерти клеток.