Когда эритроциты, взвешенные в 0,85-процентном растворе хлористого натрия, содержащем 15% глицерина, замораживали при —79° и затем оттаивали, гемолиз в большей степени происходил в больших пробах (500 мл), а не в малых (2—5 мл).
Это натолкнуло на мысль о том, что повреждения могли возникнуть вследствие более медленного охлаждения и таяния в больших пробах.
Лавлок исследовал причины гемолиза человеческих эритроцитов во время замораживания и таяния, а также механизм защитного действия глицерина, предотвращающего гемолиз. Он показал, что повреждение эритроцитов в среде, не содержащей глицерина, во многом обусловлено действием более высоких концентраций солей, чем 0,8 М NaCl, во время вымораживания воды при температуре от —3 до —40°.
Гемолиза удавалось избежать, когда вследствие быстрого замораживания и оттаивания длительность воздействия крепких растворов хлористого натрия была менее 3 сек. В присутствии глицерина концентрация растворенной соли, уравновешенной со льдом, снижалась при любой температуре соответственно соотношению числа молекул глицерина и хлористого натрия в исходном растворе. В предварительных опытах разбавитель приготовляли, смешивая 30 объемов глицерина (удельный вес при 20° приблизительно 1,26) с 70 объемами 0,85-процентного раствора хлористого натрия при комнатной температуре. Таким образом, полученный раствор содержал около 38% (по весу) глицерина или был 4,0 М. Концентрация хлористого натрия снижалась приблизительно до 0,6% (примерно 0,1 М). К этому разбавителю добавляли равный объем цельной крови. Конечная концентрация глицерина в смеси была примерно 2 М (15% по объему или 19% вес/объем).
Лавлок подсчитал, что для предотвращения повышения концентрации хлористого натрия от 0,15 М до критической (вызывающей повреждение) 0,8 М при температуре ниже —40° во время медленного выделения льда при охлаждении больших объемов эритроцитов до —79° требуется 2,9 М (20-процентный по объему или 25-процентный вес/объем) раствор глицерина. По его мнению, целесообразно понижать начальную концентрацию хлористого натрия до 0,12 М.
Примерно в это же время Чаплин и Моллисон нашли, что интенсивность гемолиза, наступающего во время замораживания, и оттаивания крови, в равной степени зависит от конечной концентрации глицерина и от скорости замораживания. Повышение концентрации глицерина (до 20—30% по объему) увеличивало процент восстановленных клеток при замораживании больших объемов крови. Эти авторы также нашли, что понижение концентрации хлористого натрия давало положительный эффект. Они хранили 420 мл человеческой крови, смешанной со 120 мл стандартного кислого цитратно-декстрозного раствора, при температуре +4° не более 7 дней. Из этой смеси удаляли 240 мл цитратной плазмы, а оставшиеся 300 мл клеточной взвеси разбавляли 200 мл смеси, содержащей 50% (по объему) глицерина и 0,425% хлористого натрия. Таким образом, конечная концентрация глицерина составляла приблизительно 20% по объему или 25% по весу, а конечная концентрация хлористого натрия — около 0,2%. При вращении колб с разбавленной таким образом кровью в ванне с температурой —79° их содержимое застывало в течение 8—10 мин, а без вращения — в течение 15—20 мин. Гемолиз после оттаивания был незначительным и не превышал 5% независимо от скорости охлаждения колб с кровью.
Браун и Хардин, проводившие независимо аналогичные исследования, установили, что интенсивность гемолиза, возникающего во время охлаждения эритроцитов до —79° и последующего оттаивания, можно значительно уменьшить путем повышения концентрации глицерина в суспензионной среде. При замораживании в присутствии глицерина в более высоких концентрациях можно было, не вызывая гемолиза, увеличить количество клеток по отношению к суспендирующей жидкости и уменьшить скорость охлаждения и оттаивания. Авторы показали, что эритроциты человека, помещенные непосредственно в 30—35-процентный (вес/объем) раствор глицерина (3,2—3,8 М глицерин), не гемолизируются в течение 2 час при температуре 4-5°. Клетки, предварительно уравновешенные с данной концентрацией глицерина, можно переносить в 0,16 М раствор лактата натрия, содержащий до 56,25% (вес/объем) глицерина (6,0 М), без возникновения гемолиза. Затем эритроциты охладили до —70° и хранили при этой температуре. Спустя 6,25 месяца из общего числа клеток восстановилось 94%. Глицерин удаляли, отмывая порциями гипертонического раствора лактата натрия, содержащими глицерин в понижающейся концентрации. После переливания отмытых от глицерина оттаянных клеток количество переживших клеток в кровотоке реципиента варьировало у отдельных лиц от 49 до 90%, составляя в среднем 62%. Большинство погибших клеток исчезало из кровяного русла уже спустя 24 час после переливания. Данные о влиянии осмотического давления на эритроциты in vitro позволяют предполагать, что их распад связан с осмотическим эффектом, обусловленным неполным удалением внутриклеточного глицерина перед введением эритроцитов в кровоток.
Дальнейшие исследования в поисках оптимальной концентрации глицерина и различных компонентов человеческой крови, подлежащей хранению при —79°, проводили Моллисон и сотрудники. Колбы, содержащие 120 мл лимоннокислой декстрозы и 420 мл цельной крови, центрифугировали для уплотнения эритроцитов. Затем эритроциты взвешивали в одном из 5 разбавителей, содержащих в различных соотношениях глицерин и хлористый натрий или цитраты. Некоторые растворы были слегка подкислены. Один из них был забуферен фосфатами до pH 6,9. Колбы с обработанными глицерином эритроцитами замораживали при —70 или —79° и выдерживали при этой температуре от 1 дня до 21 месяца. После оттаивания определяли процент восстановившихся клеток. Затем их отмывали в серии растворов цитрата натрия с понижающейся концентрацией глицерина и еще раз определяли процент сохранившихся клеток. После этого эритроциты суспендировали в солевом растворе так, чтобы объем уплотненных клеток в различных пробах составлял примерно 40%. Некоторые пробы пометили Cr51. Оттаянные и отмытые эритроциты вводили в кровоток реципиента и спустя 24 час, а затем через различные интервалы времени определяли число выживших эритроцитов либо по методу дифференциальной агглютинации, либо с помощью измерения радиоактивности в пробах крови. В некоторых случаях число переживших замораживание эритроцитов определяли обоими методами.
Полученные результаты показали, что эритроциты, хранившиеся в течение года при —79° в физиологическом растворе, содержащем 15% (по объему) глицерина, сильно повреждались. После оттаивания гемолизировалось 68% эритроцитов, а после удаления глицерина сохранилось лишь 25%. Однако эти клетки выживали после переливания их реципиенту.
Лучшие результаты получали при повышении конечной концентрации глицерина до 28% по весу (3 М) и понижении конечной концентрации хлористого натрия примерно до 0,2%. Так, когда 180 мл уплотненных эритроцитов и 120 мл цитратной плазмы разбавили 200 мл раствора, содержащего 62% (вес/объем) глицерина и 0,425% хлористого натрия, за 1 год при температуре —79° гемолизировалось лишь 5% эритроцитов. После удаления глицерина восстановилось 70—90% эритроцитов, а 82% пережили переливание.
Более 90% клеток переживало замораживание и хранение при —79° в течение 1 года в щелочной среде, содержащей цитрат натрия (в этой среде конечная концентрация глицерина составляла около 30%), но спустя 24 час после переливания в кровотоке осталось только 70 % клеток.
Когда разбавитель содержал цитрат калия и был забуферен фосфатами до pH 6,9 или 7,0, а конечная концентрация глицерина в самих клетках и вокруг них достигала примерно 30% (3 М), около 95% эритроцитов, хранившихся при —79°, восстанавливалось после оттаивания. Из них 91—97% оставалось в кровотоке спустя 24 час после переливания, причем эти эритроциты были вполне жизнеспособными. Весьма обнадеживало то обстоятельство, что увеличение периода хранения при —79° от 1 недели до 2 лет не влияло на выживание эритроцитов человека и на, продолжительность их жизни в кровеносной системе. Несомненно, потенциальную жизнеспособность можно продлить на многие годы, в частности путем хранения клеток при низких температурах. В США уже используют охлаждение до температуры от —80 до —120° для хранения обработанных глицерином эритроцитов. В Англии этот метод еще не нашел широкого применения. Это объясняется частично тем, что в Англии служба крови пока удовлетворяет существующую потребность в крови, а частично высокой стоимостью установки и эксплуатации больших холодильников, в которых можно поддерживать столь низкую температуру. Поэтому были предприняты попытки хранить кровь в замороженном состоянии при температурах, создаваемых обычными морозильными камерами.