Гесс считает, что эти различия очень глубоки. При добавлении воды и последующем отмывании препарат цвикельпротеина быстро набухает и превращается в типичную сырую клейковину. Смесь цвикельпротеина с крахмалом образует при увлажнении тесто, характеризуемое нормальной фаринограммой и дающее при отмывании нормальную клейковину. Препарат же хафтпротеин — крахмал, по данным Гесса, не способен образовывать связного теста и клейковину из него отмыть не удается.
Хафтпротеин, очищенный от крахмала с помощью этиленхлоргидрина, также не способен образовывать клейковину при добавлении воды. Если же к фракции хафтпротеин — крахмал добавить некоторое количество цвикельпротеина, то клейковина отмывается из такой смеси в количестве, соответствующем сумме обоих белков. Таким образом, цвикельпротеин не только сам’ образует сырую клейковину, но и вовлекает в этот процесс хафтпротеин, способствуя отделению его от крахмальных зерен. Гесс предполагает, что в процессе приготовления теста каждый из исследованных им белков играет свою особую роль, причем качество клейковины зависит от соотношения в ней количеств цвикельпротеина и хафтпротеина.
В химическом отношении хафтпротеин отличается от цвикельпротеина большим содержанием липоидов. Например, по данным Гесса (1958), образец цвикельпротеина содержал 2,27% лецитина, а хафтпротеин — крахмал — 22,6% лецитина.
Небольшая часть лецитина (около 1,5—2,9% от общего его количества) связана с белком прочной химической связью, которую не удается разрушить даже при длительном экстрагировании препаратов цвикель — и хафтпротеина смесью этанола и метанола в шаровой мельнице. Далее, Гесс считает, что хафтпротеин отличается от цвикельпротеина положением изоэлектрической точки. Потенциометрическое титрование очищенных с помощью этиленхлоргидрина препаратов обоих белков в растворе 50%-ного этанола с добавлением щелочи показало, что хафтпротеин имеет основной характер вследствие наличия в нем свободных аминных групп, титруемых в присутствии формальдегида, тогда как цвикельпротеин не содержит таких групп и его изоэлектрическая точка соответствует более кислой реакции (Гесс, 1955, 1958). Гесс предполагает, что в процессе формирования теста должно происходить образование бинарных белковых комплексов из молекул цвикель. и хафтпротеина за счет электростатического взаимодействия этих белков, поскольку при реакции среды, лежащей между их изоэлектрическими точками, они будут нести противоположные заряды. Следует отметить, что экспериментальных данных для обоснования подобных представлений пока еще совершенно недостаточно. Общий аминокислотный состав цвикельпротеина и хафтпротеина, по данным Гесса (Hess, 1955), одинаков.
Вопрос о различиях между цвикель — и хафтпротеином пшеницы в последнее время был подробно исследован Н. П. Козьминой с сотрудниками (Козьмина, Ильина, Бутман, 1957; Козьмина, Наумова, 1957; Козьмина, Ильина, Бутман, Наумова, 1958; Козьмина, Бутман, Ильина, Наумова, 1959), прячем полученные ими результаты не подтверждают представлений Гесса о глубоких различиях этих белков в отношении их способности образовывать при набухании сырую клейковину.
Н. П. Козьмина и сотрудники прежде всего провели срав-нительный анализ препаратов цвикель — и хафтпротеинов из пшениц различных сортов (твердых и мягких) на содержание в них общего белка и отдельных его фракций. Применяя одну и ту же методику выделения цвикельпротеина, а именно — размол обезжиренной муки на вибрационной мельнице и фракционирование смесью бензола и хлороформа с удельным весом 1,38, эти авторы показали, что не только выход фракции цвикельпротеина, но и содержание в ней белка сильно колеблется в зависимости от исходного материала, так как при различной структуре эндосперма частицы цвикельпротеина получаются в неодинаковой степени загрязненными крахмалом.
Различные препараты цвикельпротеина пшеницы содержали от 9,80 до 14,78% азота, что соответствует содержанию белка (NX5,7) от 55,9 до 84,2%. Приблизительно такие же данные были получены также А. Б. Вакаром и Е. С. Толчинской. Цвикельпротеины, выделенные ими из пшениц с клейковиной различного качества, содержали от 57,2 до 80,9% белка. Чаще всего содержание белка в цвикельпротеинах, выделенных из смеси с удельным весом 1,380 г/мл, составляет 70—75%.
Н. П. Козьмина, Л. А. Бутман и сотрудники (1959) применили дополнительную очистку цвикельпротеина, повторно фракционируя его из смеси хлороформа и бензола с плотностью 1,330 г/мл, и получили препарат, содержавший 16,70% азота или 95,19% белка. Это — наиболее чистый из описанных в литературе препаратов цвикельпротеина.
Анализ фракций хафтпротеин — крахмал из различных пшениц показал, что содержание азота в них колеблется от 0,С8 до 2,21%, что соответствует 3,9—12,6% белка. Слой прикрепленного белка на крахмальных зернах (хафтпротеин) может быть, по-видимому, или очень тонким или более толстым. Первое наблюдается у пшениц с мучнистым эндоспермом, второе — у стекловидных пшениц (Козьмина и Наумова, 1957).
Стремясь выделить «истинный хафтпротеин», т. е. только тот белок, который находится непосредственно на поверхности крахмальных зерен в виде тонкого прочно удерживаемого слоя, Н. П. Козьмина, Л. А. Бутман и сотрудники (1959) повторно обрабатывали фракцию хафтпротеин — крахмал, полученную из жидкости с плотностью 1,38, смесями хлороформа и бензола возрастающей плотности от 1,400 до 1,493. При этом агломераты частиц крахмала и цвикельпротеина постепенно отделялись (всплывали) и содержание белка в осадке непрерывно падало до минимального значения 1,25—0,93% от веса вещества. Эти опыты показали, что получаемые в обычных условиях по методике Гесса препараты хафтпротеин — крахмал крайне неоднородны по своему составу: их можно разделить на фракции, содержащие до 30% белка и только 0,9—1,3% белка. Количественный выход указанных фракций, правда, очень незначителен и составляет лишь около 1 % от общего веса препарата хафтпротеин — крахмал.
Н. П. Козьмина, В. Н. Ильина и Л. А. Бутман (1957) проанализировали несколько препаратов цвикельпротеина и хафтпротеин — крахмала на содержание в них глобулина, глиадина и остатка, не растворимого в 70%-ном спирте.
Заметная разница между цвикельпротеином и хафтпротеином наблюдается лишь и отношении солерастворимого азота.
Если же препараты обеих белковых фракций экстрагировать последовательно солевым раствором и спиртом, то в результате повышенной растворимости хафтпротеина в солевом растворе заметно снижается содержание спирторастворимого азота в этой фракции по сравнению с цвикельпротеином.
Если к препарату цвикельпротеина добавить воду, то при замешивании белок быстро набухает и образует «тесто», отличающееся от обычного тем, что оно состоит почти целиком из белка и содержит лишь небольшую примесь крахмала. С помощью отмывания из такого теста удаляют растворимые белки и остатки крахмала и получают типичную сырую клейковину со всеми характеризующими ее физическими свойствами. Выход сырой клейковины составляет, по данным Н. П. Козьминой, 217—244% от веса взятого цвикельпротеина.
Около 25—30% сухого вещества цвикельпротеина теряется при отмывании, вследствие чего сухой вес отмытой клейковины составляет лишь 70—75% веса исходного цвикельпротеина. Хотя при отмывании происходит потеря некоторого количества водо — и солерастворимых белков, снижение сухого вещества зависит в основном от удаления остатков крахмала, вследствие чего процент белка в клейковине заметно повышается по сравнению с исходным цвикельпротеином. Если содержание белка в наиболее очищенном цвикельпротеине составляет, по данным Н. П. Козьминой, Л. А. Бутмана и сотрудников, 95,19%, причем часть этого белка относится к водо — и солерастворимой фракции и потому не является собственно клейковинным белком, то при отмывании клейковины из цвикельпротеина можно получить препараты почти стопроцентного клейковинного белка. В качестве примера приведем новые данные А. Б. Вакара и Е. С. Толчинской о содержании белка в различных образцах цвикельпротеина и в отмытой из них сухой лиофилизированной клейковине.
Соотношение спирторастворимого и спиртонерастворимого азота в клейковине, отмытой из цвикельпротеина, по данным Н. П. Козьминой и сотрудников (1957), составляет в среднем 0,8—1,0 с большими колебаниями для разных образцов белка.
В результате подробного исследования фракции хафтпротеин — крахмал Н. П. Козьмина, В. Н. Ильина и Л. А. Бутман (1957) убедительно показали, что вопреки мнению Гесса, из этой фракции можно отмыть клейковину, если применить продолжительную отлежку теста и очень осторожное, тщательное отмывание через густое сито. Процесс формирования клейковины из хафтпротеина протекает медленно, отдельные частицы ее с трудом слипаются в общую массу и потому при обычном отмывании легко получить отрицательный результат. Гесс отмывал клейковину на приборе «Тэби» и, по-видимому, всю ее растерял. Баланс азота в клейковине, промывной жидкости и отмываемом крахмале показывает (Козьмина и сотрудники, 1957), что из фракции хафтпротеин — крахмал удается выделить в среднем около 60% того количества клейковины, которое должно содержаться в этой фракции по расчету, исходя из количества общего азота за вычетом солерастворимого азота. Если же к фракции хафтпротеин — крахмал добавить 5—10% (по весу) цвикельпротеина, то выход Клейковины из такой смеси повышается до теоретически возможного, TL е. весь хафтпротеин вовлекается в процесс формирования сырой клейковины, на что указывал и Гесс. Меньшее количество цвикельпротеина в смеси не вовлекает связанный с крахмалом белок в клейковинный комплекс. Для того чтобы доказать, что именно хафтпротеин, а не присутствующие во фракции хафтпротеин — крахмал остатки неизвлечен — ного цвикельпротеина образуют при отмывании сырую клейковину, Н. П. Козьмина, Л. А. Бутман, В. Н. Ильина и А. Т.Наумова (1959) получили методом, описанным выше, высокоочищенные препараты хафтпротеин — крахмала, со-державшие только 0,37% азота (2,11% белка), и показали, что из них можно отмыть клейковину, правда, в количестве, составляющем лишь 9,5% теоретически возможного выхода.
Серией специальных опытов те же авторы экспериментально показали, как снижается выход сырой клейковины при искусственном разбавлении муки и белковых фракций (цвикельпротеина и хафтпротеин — крахмала) чистым крахмалом. Оказалось, что особенно затрудняется процесс отмывания клейковины в тех образцах, где белок подвергался предварительно сильному механическому воздействию, например интенсивному помолу на вибрационной или шаровой мельнице, в результате чего, как известно, качество клейковины резко ухудшается.
На основании полученных данных авторы приходят к заключению, что трудности отмывания клейковины из препаратов хафтпротеина являются результатом плохого слипания набухших частиц белка, разъединенных значительным количеством крахмала, тем более что способность белка к слипанию снижена механическим воздействием во время предварительного измельчения материала. Добавление цвикельпротеина повышает общий процент белка в смеси, что увеличивает возможность соприкосновения и слипания набухающих белковых частиц в общую массу сырой клейковины. В этом и заключается, по-видимому, механизм вовлечения хафтпротеина в процесс формирования клейковины с помощью цвикельпротеина.
Что касается данных Гесса о невозможности получения сырой клейковины из препаратов хафтпротеина, очищенных от крахмала с помощью этиленхлоргидрина, то, подтвердив эти данные, Н. П. Козьмина, В. Н. Ильина и Л. А. Бутман (1957) показали, что цвикельпротеин под действием этиленхлоргидрина также полиостью утрачивает свою первоначальную способность формировать при набухании клейковинный студень. Следовательно, этиленхлоргидрин оказывает на белки сильное денатурирующее действие. Это подтверждается также резким снижением растворимости как цвикельпротеина, так и хафтпротеина в 70%-ном спирте после обработки их этиленхлоргидрином. Для цвикельпротеина растворимость в спирте снизилась с 58 до 15% от общего азота, а для хафтпротеина — с 50 до 7%. Сильное денатурирующее действие этиленхлоргидрина на белки пшеницы обесценивает в значительной мере данные Гесса о различиях в изоэлектрических точках цвикельпротеина и хафтпротеина и о механизме их взаимодействия, поскольку эти данные Гесс получил, работая с белками, совершенно изменившими свои природные свойства.
Дальнейшие доказательства способности хафтпротеина формировать клейковину были получены Н. П. Козьминой и сотрудниками (1957) в опытах по растворению хафтпротеина в 0,01 п муравьиной кислоте с последующим осаждением белка путем нейтрализации раствора гидратом окиси кальция. Выпадавший при этом осадок представлял собой типичную клейковину с характерной упругостью и содержанием 82— 907о белка на сухое вещество.
Подводя итоги изложенному материалу, следует прийти к заключению, что глубоких структурных различий между цви-кельпротеином и хафтпротеином, по-видимому, нет. Можно считать доказанным, что обе эти фракции способны в известных условиях формировать гидратированный студень сырой клейковины. В то же время нет достаточных оснований считать их совершенно идентичными. Возможно, что различия между цвикель — и хафтпротеином имеют тот же характер, что и различия между белками, образующими клейковину с неодинаковыми физическими свойствами. Тот факт, что хафтпротеин находится в эндосперме, на поверхности крахмальных зерен, тогда как цвикельпротеин занимает промежутки между ними, возможно, указывает на определенные различия во времени синтеза этих белков при созревании зерна. А так как в процессе созревания биохимические условия в зерне меняются, то и свойства белков, синтезированных в разные фазы спелости, могут быть неодинаковыми. В настоящее время, однако, нет никаких экспериментальных данных о цвикель — и хафтпротеине в эндосперме созревающей пшеницы и поэтому вопрос о первоначальном синтезе этих фракций в зерне остается пока открытым.