В 1948 г. нельзя было рассчитывать на какие-то перспективы в отношении использования низких температур для продолжительной консервации живых клеток.
Наши попытки повторить опыты Шаффнера, Хендерсона и Карда по замораживанию птичьих сперматозоидов не имели большого успеха. В пробах спермы, обработанных левулозой и быстро охлажденных в виде тонкой пленки или в капиллярах до температуры —79 или —196°, погибали все сперматозоиды, а при замораживании в ампулах или в маленьких пробирках подвижность восстанавливалась лишь у очень немногих. При окрашивании проб обнаружили, что у большинства сперматозоидов шейка и головка полностью разрушены. Тогда мы поместили концентрированный раствор левулозы в холодильник, а сами стали изыскивать другие методы хранения спермы петуха in vitro. После нескольких месяцев напряженной работы мы так и не добились сохранения оплодотворяющей способности у спермы петуха in vitro в течение более 8—12 час при любой температуре выше нуля и поэтому вернулись к проблеме хранения сперматозоидов при низких температурах. Мы извлекли из холодильника колбу с этикеткой «левулоза» и начали опять применять последнюю в качестве разбавителя спермы. Против всяких ожиданий сперматозоиды выживали после охлаждения до температуры —79° и последующего согревания. Между тем свежие растворы левулозы по-прежнему совершенно не оказывали защитного действия против повреждений, вызываемых замораживанием и оттаиванием. Вначале у нас возникло подозрение, что изменения биологических свойств раствора и отсутствие в нем редуцирующих сахаров обусловлены появлением за время хранения плесени. Д-р Д. Эллиот подверг раствор анализу и обнаружил в нем около 10% глицерина и 1% альбумина. Мы были поражены полученными результатами, пока до нашего сознания не дошло, что мы замораживали сперматозоиды в мейеровском белковом растворе, который ранее применяли для обработки мазков сперматозоидов при подготовке их к окрашиванию и микроскопии. Этот раствор, в который не добавили, как обычно, кристалла тимола, препятствующего росту бактерий и плесени, поместили в холодильник вместе с раствором левулозы. Впоследствии об этом забыли, а во время хранения этикетки с колб, очевидно, упали и их случайно поменяли местами.
Мы проверили отдельно защитные свойства глицерина и яичного альбумина. Пробы спермы петуха разбавили в маленьких пробирках в равных объемах раствора Рингера, содержащего 20—40% глицерина. Затем их погрузили в замораживающие смеси с температурой —79°. После оттаивания у сперматозоидов наблюдалась нормальная подвижность. Морфологически они ничем не отличались от незамороженных контрольных сперматозоидов. Другие пробы разбавили растворами белка, заморозили и согрели аналогично первым. При этом сперматозоиды разрушились и погибли. Не лучше обстояло дело с восстановлением подвижности у сперматозоидов петуха и в тех случаях, когда к раствору Рингера, содержащему глицерин, добавили белок. Ни один сперматозоид не пережил замораживания в растворе Рингера. Отсюда стало ясным, что именно глицерин защищает клетки от повреждений, вызываемых охлаждением до очень низких температур и последующим согреванием.
Интересно, что в присутствии глицерина большая часть сперматозоидов петуха переносила удаление 80— 90% воды при низких температурах. Обезвоживание осуществляли путем возгонки в высоком вакууме. При этом температура образца повышалась от —79 до —25°. Предварительные испытания показали, что сперматозоиды кролика не переносят присутствия в обычном разбавителе спермы более 5% глицерина. Лишь немногие из них пережили быстрое охлаждение до —79° и последующее согревание. В то же время относительное количество сперматозоидов человека, перенесших охлаждение до —79°, значительно увеличивалось, когда в разбавитель добавляли 5 или 10% глицерина.
Защитное действие глицерина мы обнаружили совершенно случайно, хотя в то время уже было опубликовано немало работ, которые могли бы послужить для нас указанием. Однако мы не имели об этих работах ни малейшего представления. Не попали они в поле зрения и других исследователей. Так, например, мы не знали, что Ростану удавалось сохранять подвижность у сперматозоидов лягушки в течение б—20 дней при температуре от —4 до —6° в частично замороженной среде, содержащей 10—20% глицерина. Вместе с тем Ростан отмечал, что в подобных же условиях глицерин не оказывал никакого защитного действия на сперматозоиды млекопитающих. Еще в 1912 г. Н. А. Максимов использовал глицерин для защиты растительных тканей от повреждений, наступающих во время замораживания и оттаивания. Однако он нашел, что в этом отношении глицерин менее эффективен, чем сахара.
На мысль о целесообразности применения глицерина могли бы натолкнуть также работы Люйета и Хартунга. Эти авторы показали, что предварительная обработка этиленгликолем увеличивала процент выживания уксусных угриц, подвергшихся сверхбыстрому охлаждению до температуры жидкого азота с последующим согреванием. Позднее мы вспомнили, что как этиленгликоль, так и глицерин представляют собой многоатомные спирты, используемые в качестве антифриза, и подумали, что, возможно, глицерин оказывает защитное действие на сперматозоиды человека и птиц, подавляя образование кристаллов льда и способствуя витрификации воды, согласно теории Люйета. Однако вскоре в результате изучения процесса замораживания под микроскопом и других исследований мы вынуждены были отказаться от этого предположения.