Качество питательных сред и условия культивирования для получения бруцелл в первой генерации имеют очень важное значение не только для количества результативных исследований, но и для выделения возбудителя болезни с наименьшими признаками диссоциации.
Стабильность последующих генераций также зависит от условий культивирования и состава питательных сред. Поэтому хотя изготовление питательных сред производится строго по рецептам, все же необходимо в диагностических лабораториях отрабатывать методику приготовления и контроля питательных сред. Требуется испытывать их качество на референтных штаммах бруцелл. Это особенно важно при использовании нестандартных ингредиентов среды.
В 5-м докладе Комитета экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ предлагается испытать основные питательные среды (в которые не добавляются ингибиторы) на рост клеток 2-го биотипа Br. abortus при незначительном их содержании (5 -10 клеток) о засеваемом материале.
Наиболее популярной средой, рекомендованной указанным Комитетом, является селективный сывороточно-декстрозный агар, на котором Br. abortus, Br. melitensis и Br. suis и их биотипы растут лучше, чем на других средах. Эта среда содержит 5% сыворотки крови и следующие антибиотики: бацитроцин, полимиксин В и циклогексимид. Кроме того, амфотериксин может заменить циклогексимид или может быть добавлен к нему.
Считается, что добавление красок может частично препятствовать росту биотипов основных видов бруцелл, но краски все же рекомендуются.
Ниже приводится методика изготовления питательных сред, использующихся в нашей стране.
Плотный печеночно-глюкозно-глицериновый агар (ППГГА). Эту среду применяют для исследования и культивирования Br. abortus, Br. melitensis и Br. suis.
Берут 400 г свежей говяжьей печени, освобождают ее от жора и пленок, измельчают на куски по 5—8 г, добавляют 0,5 л водопроводной воды и кипятят в течение 1 ч (при большом объеме мечет, загружают в кипящую воду). Затем фильтруют через нейлоновый или ватный фильтр.
Этот печеночный отвар разводят пополам водопроводной водой, добавляют 1% пептона, 0,5% химически чистого хлорида натрия, 2,5% агара и 17 мл на 1 л 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия.
Затем среду автоклавируют при 115° С в течение 20 мин, отстаивают в автоклаве 3—4 ч до осаждения грубых частиц и фильтруют в горячем виде через ватный или нейлоновый фильтр, устанавливают pH 7—7,2. В этот печеночный агар добавляют 1 % виноградного сахара и 2—3% глицерина. Среду разливают в пробирки или посевные колбы и стерилизуют однократно при температуре 110° С в течение 20— 25 мин.
На этой свежей (до 3-суточной давности) среде без ингибиторов при первичном посеве хорошо растут бруцеллы из свежих или замороженных абортированных плодов и отдельных органов животных, убиваемых с диагностической целью, содержимого полостей, абсцессов. Длительные пересевы музейных штаммов не вызывают большой их изменчивости. Эту же среду применяют при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл.
Полужидкий сывороточный агар. Данную среду готовят по следующей прописи. Берут печеночного отвара (см. выше) и мясного настоя по 25%, водопроводной воды — 50%, добавляют пептона 1%, хлорида натрия — 0,5%, агара — 0,15—0,2%, устанавливают pH 7—7,2. Смесь разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при 115° С в течение 20—25 мин. Хранят среду при 0—4° С. Перед употреблением к среде добавляют 10% стерильной овечьей или бычьей сыворотки и разливают в пробирки,
Сывороточно-декстрозный агар. К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15 г агара, 10 г пептона, 5 г химически чистого хлорида натрия и 165 мл мясной воды. После смешивания содержимое колбы обрабатывают текущим паром в течение 1 ч. Устанавливают pH 7,8. Затем среду автоклавируют в течение 30 мин при 127° С (0,2 М/Па) для осаждения фосфора. После автоклавирования среду фильтруют через бумажный фильтр, регулируют pH до 7,4, разливают смесь в мерную посуду, стерилизуют при 116 С в течение 15 мин. Перед употреблением среду расплавляют, остуживают до 50 С, после чего к ней добавляют нормальную лошадиную или бычью сыворотку и раствор декстрозы. Эту смесь предварительно фильтруют через фильтр Зейтца. Окончательная концентрация сыворотки в среде должна быть 5%, декстрозы— 1%.
Печеночный агар Хеддлесона. Вначале готовят печеночный отвар. К 500 г свежего фарша из говяжей печени (без жира и пленок) добавляют 500 мл воды, затем кипятят в течение 1 ч при помешивании, фильтруют через ватно-марлевый или нейлоновый фильтр и стерилизуют в автоклаве.
Для изготовления агаровой среды берут 500 мл воды, 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 20 г агара и автоклавируют в течение 30 мин, затем добавляют к среде 500 мл печеночного отвара, охлаждают до 60° С, устанавливают pH 7. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют в течение 30 мин при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH 7, разливают и стерилизуют в автоклаве при 115° С в течение 30 мин.
Среда Первушина для выделения гемокультур. Мясо-пептонный бульон (МПБ), содержащий 1% глюкозы и 4% глицерина, разливают в колбы по 100 мл. Затем вводят в них по 0,5 г гигроскопической стерильной ваты. Стерилизуют и используют для посева крови.
Полужидкий агар (ПЖА) и МПБ с добавлением 1 % глюкозы и 2—3% глицерина без введения в колбы комков ваты могут быть использованы для выращивания бруцелл из крови животных и других материалов, пробы которых в стерильном состоянии.
Картофельный агар Корнеевой. Берут хорошо очищенный картофель в количестве 500 г, нарезают ломтиками, варят в 1 л водопроводной воды. Затем отвар фильтруют через слой гигроскопической ваты и доливают водой до 1 л. На 1 л фильтрата добавляют следующие ингредиенты: хлорида натрия — 5 г, пептона — 10 г, глицерина — 30 г, глюкозы—10 г, ангара — 20 г для пробирок и 30 г для колб. Смесь варят до расплавления агара, затем ее отстаивают в теплом месте. В остывшем агаре нижний слой с осадком срезают, а прозрачную часть агара режут кусочками и расплавляют. Расплавленный агар фильтруют через ватный фильтр, устанавливают pH 7. Стерилизуют при 115° С в течение 20—30 мин и устанавливают pH 6,8.
Среда Кроля. Указанную среду применяют при выделении культур бруцелл из молока. К печеночному агару Хеддлесона добавляют насыщенный раствор генцианвиолета в соотношении 1 : 100000. Выращивают первые 15 ч в обычных условиях, а затем при наличии в сосуде 10% СO2.
Среда Moore и др. Эту среду применяют для выделения культуры Br. canis из крови собак. В колбе вместимостью 100 мл готовят скошенный триптозный агар (коммерческий). Затем в эту же колбу вводят 15 мл бульона, приготовленного из мозга и мышцы сердца крупного рогатого скота. Затем берут по 2 мл крови в асептических условиях из яремной вены собак и тут же добавляют ее в среду, тщательно смешивают и инкубируют 3 нед, придав колбам наклонное положение, чтобы часть плотной среды была открыта.
Наиболее целесообразными являются посевы на плотные среды свежевзятого материала. На плотных средах растут изолированные колонии, что обеспечивает меньшую их диссоциацию по сравнению с жидкими средами. Отсев на плотную среду с жидких сред следует производить через 2—3-е сут. При выращивании культуры бруцелл на жидкой среде, в которой находились одновременно посторонние микроорганизмы, чаще обнаруживаются измененные варианты.
Из загрязненного посторонней микрофлорой материала, например, несвоевременно доставленные абортированные плоды (направленные в незамороженном и неохлажденном виде через сутки после выкидыша), куски плаценты, отдельные органы животных или плодов, моча, содержимое полостей трупов и др., лучше производить параллельно биопробу на морских свинках или белых мышах.
Посевы следует делать на ППГГА с содержанием в нем генцианвиолета или кристаллвиолета, которые в виде насыщенного, водного раствора вводят в среду в соотношении 1 : 200000.
При посевах крови в комбинированных условиях (косяк ППГГА + жидкая среда) СO2 может быть введен в колбу через резиновую нетолстую пробку, под давлением, через иглу со шлангом, соединенным с источником СO2.
Посевы на куриные эмбрионы и жировые (неоплодотворенные) яйца кур лучше производить только материалом, взятым в стерильных условиях.