На жидких средах выращивают микробиологически чистые мицелиальные культуры, предварительно выделенные из плодовых тел, спор съедобных грибов или субстрата, пронизанного мицелием гриба. Выделение чистой мицелиальной культуры и ее идентификация — важный этап, гарантирующий успех всей дальнейшей работы по культивированию мицелия.
Чистые культуры базидиомицетов могут быть выделены из плодовых тел, базидиоспор (путем их проращивания), из корней микоризообразующих растений или же из почвы, древесины и других субстратов, являющихся средой обитания этих грибов. Наиболее простым и удобным способом получения желаемых культур высших базидиальных грибов является выделение культур из плодовых тел или базидиоспор, если последние легко прорастают. Выделение культур из субстрата или микоризных окончаний корней, применяющееся для специальных исследований, малоэффективно, и идентификация полученных культур представляет большие трудности.
Выделение чистых культур из плодовых тел. При выращивании мицелия съедобных грибов на жидких средах обычно преследуется цель получения штаммов, характеризующихся быстрым и обильным ростом мицелия с высоким содержанием белка, независимо от качества плодоношения этих штаммов. В этом случае поиск продуцентов, как правило, ведется в природе. В случае же, если целью выращивания является получение регенеративного (посевного) мицелия для производства плодовых тел, необходимо проводить выделение чистой мицелиальной культуры из плодовых тел отселекционированных культивируемых рас, выращиваемых в теплицах.
В природе сбор плодовых тел лучше проводить в сухую погоду в период их массового появления. Следует выбирать молодые неповрежденные плодовые тела, так как они меньше инфицированы микроорганизмами. Хранить плодовые тела можно в течение 2—3 недель в холодильнике в полиэтиленовых мешочках.
Обработка плодовых тел. Плодовое тело следует осторожно очистить от прилипших растительных остатков, соскоблить почву с ножки, промыть в проточной и стерильной воде и положить на фильтровальную бумагу, чтобы оно просохло. Промывать плодовые тела нужно быстро, чтобы они не напитались водой. Плодовое тело можно простерилизовать, обтирая 96-градусным спиртом или погружая на несколько секунд в 1%-ный раствор сулемы, 3%-ный раствор перекиси водорода, раствор формалина (1 : 300); в последнем случае плодовое тело следует тщательно отмыть в воде и дать обсохнуть. Плодовое тело можно также быстро обжечь над пламенем горелки.
Выделение инокулюма. Предварительно обработанное одним из описанных выше способов плодовое тело разламывают и кусочек ткани из середины переносят стерильным скальпелем, ланцетом или копьем на питательную среду. Ни в коем случае нельзя обжигать инокулюм в пламени горелки! Выделение культуры производят из разных частей плодового тела — шляпки, ножки, места перехода шляпки в ножку, гимениального слоя. При выборе участка ткани нужно исходить из размеров и строения плодового тела. Лучше использовать самую толстую его часть. Для болетальных грибов особенно рекомендуется основание ножки. В некоторых случаях вокруг кусочков плодового тела из основания ножки появляются зачатки плодовых тел, как это наблюдается у белого гриба.
У грибов с мелкими и тонкими плодовыми телами культуру можно выделить путем посева кусочков из мелко нарезанных ножек или пластинок. Выделение культуры из гимениального слоя лучше проводить, когда плодовое тело молодое и шляпка не развернута или затянута снизу покрывалом; у болетальных грибов — пока трубочки гименофора еще закрыты. Целесообразнее отбирать внутренние, стерильные части грибной ткани. Выделение культуры идет более успешно, если брать крупные кусочки (0,5—1,5 см в диаметре).
Части плодового тела помещают на питательную среду в чашки Петри, чашечки для тканевых культур или пробирки. Расход среды при посеве на чашки для тканевых культур (диаметр 4—5 см) незначителен, в каждой такой чашке находится только один кусочек, что важно для предотвращения загрязнения. Кусочки плодового тела помещают сверху на агар или частично погружают в агаризованную среду. Инокулюм плохо выделяющихся видов лучше сначала на несколько дней поместить в чашку Петри на смоченную стерильной водой фильтровальную бумагу. Когда в такой влажной камере инокулюм покроется растущим мицелием, его переносят на питательную среду.
Таким же образом рекомендуется производить выделение культуры у дереворазрушающих грибов. Во влажную камеру помещают тщательно отмытые разрезанные плодовые тела или же кусочки древесины, пронизанные мицелием гриба. Чашки с инокулюмом помещают в термостат при 20—25° С. При 26—28° и выше скорость выделения может замедляться. В жаркое время года чашки с инокулюмом на 1—2 дня помешают в холодильник при 4-5—10° С, а затем переносят в термостат. Желательно, чтобы относительная влажность воздуха была не ниже 80%, для чего в термостат можно поставить сосуд с водой.
Молодой растущий мицелий появляется на кусочках плодовых тел у разных видов в разные сроки: от нескольких дней до 3—4 недель. В последнем случае кусочек плодового тела лучше помещать сразу в пробирку, что предохраняет его от высыхания, или же заклеивать чашки лейкопластырем.
Выделение культур производят обычно на твердую среду: сусло-агар, солодовый агар, картофельно-глюкозный агар, мальц-агар и т. д. Если выделение идет плохо или мицелий не переходит с инокулюма на поверхность среды, в состав последней следует добавить дрожжевой автолизат, отвары коры, хвои или листьев различных высших растений (обычно в количестве от 0,1 до 5%), экстракты из плодовых тел грибов (4—5%).
Грибные экстракты готовят следующим образом: плодовые тела измельчают, заливают холодной водой так, чтобы она покрывала плодовые тела, и ставят на холод на сутки. После этого жидкость отфильтровывают и трижды стерилизуют текучим паром.
В чашке Петри вместе с колониями базидиальных грибов могут расти колонии плесневых грибов, дрожжей, бактерий, что обычно легко заметить. В таких случаях предполагаемые колонии базидиомицетов нужно последовательно пересеять с последующим микроскопическим контролем и избавиться от инфекции с помощью обычных методов микробиологической техники. Для подавления роста бактерий, загрязняющих грибные культуры, рекомендуется проводить выделение на подкисленный агар (pH 4,5—5,0), добавлять антибиотики или лучше их комбинации (пенициллин — 200 ед., стрептомицин — 100 ед. в 1 мл среды и др.).
Для выделения чистых культур базидиомицетов можно использовать также жидкие среды с набором витаминов и слабой концентрацией питательных веществ, раствор мальц-экстракта (0,8%). Жидкие среды бывают эффективны в тех случаях, когда не удается выделить культуру на агаризованную среду.
Легко выделяется культура таких грибов, как Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm., Armillariella mellea (Vahl.) Fr., Coprinus comatus (Fr.) S. F. Gray, Lepista nuda (Fr.) W. L. Smith, Clitocybe nebularis (Fr.) Quel, Macrolepiota procera (Fr ) Sing., Pholiota squarrosa (Fr.) Quel, и т. д., многих афиллофорзльных и гастеромицетсв. Кусочки плодовых тел таких грибов, помещенные на питательную среду или во влажную камеру, быстро покрываются растущим мицелием, бактериальное загрязнение незначительно. Кусочки плодовых тел Cantharellus cibarius Fr., видов Gomphidius обычно обильно зарастают бактериями.
Некоторые грибы, особенно из родов Lactarius и Russula, с трудом выделяются в культуру, несмотря на отсутствие бактериального загрязнения. О. Модесс и П. Микола приводят списки грибов, которые не растут в культуре. Однако весь вопрос, очевидно, заключается в умелом подборе оптимальных условий для их роста. Трудно выделяются в культуру и скудно растут на обычных средах многие виды Amanita, Cortinarius, Clitocybe vibescina, Pluteus atricapillus (Seer.) Sing., Tricholoma vaccinum (Pers. ex Fr.) Kumm., Tricholomopsis platyphylla и др. У группы так называемых приспособительных видов наблюдается медленный рост колонии вокруг инокулюма. К таким видам относят Agaricus silvaticus Seer., Calocybe gambosa, Tricholoma georgii Fr., Mycena poligrama (Bull, ex Fr.) S. F. Gray и др.
Следует иметь в виду, что разные штаммы одного и того же вида могут значительно отличаться по скорости роста и требованиям к питательной среде. По-разному проходит выделение в культуру в различное время года и из плодовых тел неодинакового возраста. По интенсивности роста в культуре могут отличаться и штаммы, выделенные из разных экологических условий, различных географических зон.
Выделение чистых культур из базидиоспор. В тех случаях, когда размеры, строение или консистенция плодовых тел не позволяют произвести выделение культуры, ее получают из базидиоспор. Этот способ используется и для проведения специальных биологических, в частности генетических исследований. Было также установлено, что культуры, полученные из базидиоспор, обладают некоторыми свойствами (например, противоопухолевой активностью), которые отсутствуют у культур, полученных из плодовых тел. Базидиоспоры большинства подстилочных сапрофитов, копрофильных, лигнофильных и других немикоризных грибов прорастают обычно легко. Проращивание же базидиоспор многих микоризообразователей представляет значительные трудности. Различными исследователями были пророщены споры микоризообразующих грибов из родов Amanita, Boletus, Cortinarius, Hydnum, Paxillus, Russula, Tricholoma и некоторых других.
Хранение и посев спорового материала, сроки прорастания. Проращивание базидиоспор производят или непосредственно после сбора плодовых тел, или же хранят споровую массу до посева. Плодовые тела гастеромицетов перед посевом или хранением следует высушить в течение нескольких дней при комнатной температуре неразрезанными. Недозрелые плодовые тела оставляют до созревания, о чем судят по побурению глебы.
Оптимальные сроки хранения спорового материла неодинаковы не только у разных видов, но и у базидиоспор, полученных от плодовых тел одного и того же вида. У видов рода Boletus споры прорастают как на 2—4-е сутки после сбора, так и после годичного хранения при низких температурах. У Calvatia gigantea Fr. оптимальный процент прорастания спор отмечен после 8—14 месяцев хранения при температуре от—18 до+12° С. Споры Schizophyllum commune Fr. прорастали после хранения в вакууме более чем 50 лет.
Посев базидиоспор производят в чашки Петри в виде однородной водной суспензии с определенной концентрацией спор на агаризованную среду (лучше глубинно). Успех прорастания зависит от правильной концентрации спор, которая подбирается для каждого вида и иногда для каждого плодового тела. У Calvatia gigantean оптимальная концентрация базидиоспор для разных плодовых тел лежит в пределах 1—43 млн. спор на чашку. Базидиоспоры грибов из рода Mecena прорастают хорошо при концентрации в чашке от нескольких сотен до нескольких тысяч. Споры Agaricus campestris лучше прорастают в массе, чем отдельные споры.
Можно производить посев базидиоспор и непосредственно из плодовых тел по методу Н. Фриза:
Плодовые тела собирают в день опыта или за день и тогда хранят в холодильнике при +3°С. Шляпку гриба с помощью вазелина прикрепляют под крышку пустой стерильной чашки Петри. Агаровую среду разливают в другие чашки, крышки которых поочередно на 5 мин заменяют крышкой с плодовым телом. За это время в чашку успевают попасть от нескольких сотен до нескольких тысяч базидиоспор. Если плодовые тела малы, то можно брать по несколько штук. В этом случае для получения однородного спорового материала желательно брать плодовые тела, произрастающие в одном месте.
По методу П. И. Клюшника для прорастания базидиоспор используют условия, близкие к природным. Свежесобранные базидиоспоры помещают между предметными стеклами и закапывают в почву на глубину около 5 см. Прорастание их у представителей разных родов и видов наступает в разные сроки. Из базидиоспор вырастает первичный мицелий, состоящий из тонких тонкостенных многоклеточных гиф. Появление заметных колоний происходит обычно в течение 30 дней, но у некоторых видов от высева спор на питательную среду до образования колоний проходит 2—3 месяца. У Mycena rosea 99—100% спор прорастают уже через 12 ч после посева; появление колоний из базидиоспор у видов рода Lycoperdon, Calvatia gigantea наблюдается через 30 дней. Процент всхожести у многих микоризообразующих грибов очень низок (0,001—1%).
Питательные среды. Для проращивания спор используют водный агар (2,5%), сусло-агар, мальц-агар, питательную кислую желатину, синтетические среды с тиамином и различные природные субстраты — экстракты плодовых тел грибов, дрожжей, листьев, хвои, почвы, навоза и т. д. Споры многих гименомицетов прорастают в присутствии экстракта пищеварительного тракта слизняка. Выбор подобных стимуляторов следует вести, основываясь на тех экологических условиях, в которых обитает гриб.
Стимулирующее действие на прорастание базидиоспор оказывают живые дрожжи, в частности Torula sanguinea. Инокуляция дрожжевой культурой проводится через 24 ч после посева спор гриба в чашки Петри. Прорастание базидиоспор некоторых видов сыроежек происходит только в присутствии живых корней высших растений, причем не только древесных, но и томата. Наличие живых корней стимулирует прорастание базидиоспор Suillus luteus, S. piperatus (Fr.) Kuntz.
При составлении синтетических сред для проращивания базидиоспор следует иметь в виду, что прорастание может тормозиться при высоком содержании питательных компонентов в среде. Установлено, что для спор многих базидиомицетов токсичны ионы аммония. Так, прорастание спор у видов рода Mycena подавляется при наличии в среде 0,1—0,5% виннокислого аммония. Прорастание базидиоспор может происходить и просто в воде, однако вода из водоемов, не подвергавшаяся стерилизации, и морская вода оказывают на их прорастание ингибирующее действие. Чтобы избежать бактериального загрязнения, в питательную среду так же, как при выделении культур из плодовых тел, добавляют антибиотики.
Температура, оптимальная для прорастания базидиоспор, может значительно варьировать у разных видов и разных штаммов в пределах вида. Температурный оптимальный интервал может изменяться в зависимости от состава питательной среды. Обычно оптимальные температуры для прорастания базидиоспор лежат в пределах 15— 30° С.
Для успешного прорастания многие базидиальные грибы — Раxillus involutus Fr. ex Batsch., Tricholoma equestre (Fr.) Quel., некоторые виды Flammulina, Marasmius, Agaricus, Lactarius и другие — требуют пониженных температур, как это имеет место в природе. После охлаждения споры должны быть перенесены в температурные условия, оптимальные для прорастания. Базидиоспоры некоторых копрофильных грибов, проходящих через пищеварительный тракт перед прорастанием в природных условиях, можно стимулировать предварительным нагреванием до температуры 37—40°С.
Свет необходим для прорастания преимущественно тем грибам, на которые оказывает стимулирующее действие предварительное охлаждение. Однако пока имеется очень мало экспериментальных данных по влиянию светового спектра и количества света на прорастание базидиоспор. Здесь важно правильно сочетать температуру и свет.
Влажность. Для прорастания базидиоспор необходимо поддерживать относительную влажность воздуха не ниже 80%. Для сохранения высокой влажности в чашках Петри рекомендуется помещать их в эксикатор или заклеивать лейкопластырем, изоляционной лентой, ставить сосуд с водой в термостат.
Активирование прорастания. Для преодоления периода покоя базидиоспор применяются различные средства: предварительное охлаждение или нагревание, чередование охлаждения и нагревания, чередование увлажнения и высыхания, физическое воздействие на споровую оболочку путем растирания базидиоспор с кварцевым песком, встряхивание суспензии спор с мелкими частицами стекла и т. д. Для активирования прорастания применяется также обработка базидиоспор различными химическими веществами. Из неорганических веществ употребляют серную, соляную, фосфорную и азотную кислоты, азотнокислый кальций, аммонийные соединения. С этой же целью используют этиловый и другие спирты, ацетон, хлороформ, бензин, альдегиды. К активаторам прорастания относятся органические кислоты — оксалаты, ацетаты, цитраты; аминокислоты — аланин, пролин, триптофан. К мощным стимуляторам прорастания базидиоспор относятся также поверхностно активные вещества. Органические вещества, такие как алифатические спирты и эфиры, активируют прорастание спор в концентрации более высокой (в 100—1000 раз), чем растворы гетероциклических соединений (фурфурол 1 : 1 000 000).