Получение гаплоидов из 2- и 3-клеточного пыльцевого зерна возможно, но связано со сложным процессом дедифференциации таких высокоспециализированных клеток, как вегетативная, генеративная и гаметы-спермии. Это в определенной степени относится и к поздним стадиям развития микроспоры. Несомненно, этот путь получения гаплоидов реален, но в настоящее время очень сложен. Если гаплоиды и образуются из нормальной пыльцы, в их формировании могут участвовать вегетативная и генеративная клетки, либо одна из них, либо даже гаметы.
Следует подчеркнуть, что с нашей точки зрения это пока только теоретические посылки, поскольку отсутствуют детальные исследования по генезису структур, образующихся в культуре in vitro. Кроме того, первое и даже второе деление генеративной клетки или спермиев в пыльцевом зерне еще не говорит о том, что их производные будут обязательно участвовать в образовании гаплоидов-регенерантов. Как известно, возможна их элиминация на разных этапах развития гаплоида.
Для получения гаплоидных растений из исходно нормальных (после воздействия) микроспор и пыльцевых зерен необходима разработка специальных методик для выделения спорогенных комплексов, пыльцы из пыльника, спермиев и их посадка без стенки пыльника в культуру in vitro. Особенно ценна будет разработка такого метода для культивирования зрелой пыльцы. Это даст возможность получения только гаплоидных растений, поскольку в их образовании не будут участвовать ткани материнского организма — стенки пыльника, что обычно создает дополнительные трудности, так как могут получаться и негаплоидные регенеранты.
Получение гаплоидов вышеуказанными путями представляет собой сложный многоступенчатый процесс, поскольку связан с изменением детерминации, что в свою очередь связано с дедифференциацией и дифференциацией.
Следует остановиться на некоторых методических неточностях, которые, с нашей точки зрения, вносят определенную путаницу в трактовку стадий пыльника, используемого для получения гаплоидов. Эмбриологически грамотная идентификация стадий развития пыльника имеет большое значение как с теоретической, так и с практической точек зрения.
Большинство исследователей определяют фазу развития пыльника перед посадкой путем просмотра их в ацетокармине. Естественно, что они определяют эту стадию по большинству пыльцы, которую они видят в пыльнике, но она не дает гаплоиды (без воздействия). Малый процент аномалий обнаружить этим ускоренным методом сложно, отсюда и неточность выводов, которые делают некоторые исследователи. Большинство исследователей полагают, что они получают гаплоиды в этом случае из потенциально нормально развивающихся микроспор и пыльцы. Подтверждением сказанного является то, что авторы ссылаются на различные пути образования гаплоидов (А, В, С, Д) в основном только из нормально развивающейся пыльцы. Вероятно, в этом и кроется неточность определения стадии пыльника, поскольку на самом деле они получают гаплоиды из аномальных микроспор и пыльцы. Кроме того, отсутствие в литературе характеристики инициальных клеток и последовательных стадий развития эмбриоидов как из аномальных структур, так и из исходно нормальных, а также всего генезиса регенерантов в настоящее время не дает возможности присоединиться к точке зрения исследователей, считающих, что стадия микроспоры является оптимальной для получения большого количества гаплоидов. Между тем с эмбриологической точки зрения это легко объяснимо. Именно на вышеуказанных стадиях развития пыльника при посадке его в культуру in vitro начинает «работать» дефектная пыльца. Подтверждается это также тем, что для получения единичных гаплоидов необходима посадка тысяч пыльников в культуру in vitro, а также фактами, свидетельствующими, что чем более ранняя стадия развития пыльника берется для посадки, тем больше образуется гаплоидов.
Следует еще раз подчеркнуть, что стадии развития пыльника, используемые для получения гаплоидов, у различных цветковых в определенном смысле видоспецифичны. Причинами видоспецифичности являются: разный тип образования стенки пыльника (разное число слоев, различное их происхождение и т. д.), а отсюда разное ее строение на одной и той же стадии развития микроспоры и пыльцы; разный тип формирования тетрады (сукцессивный, симультанный); разный тип строения тетрады (изобилатеральный, тетраэдральный) и т. д. Однако, несмотря на вышесказанное, вероятно, можно говорить об универсальности стадии развития пыльника для индукции и получения оптимального количества гаплоидов из исходно нормально развивающейся спорогенной ткани.
В настоящее время пыльники являются структурами, наиболее часто используемыми в экспериментальной эмбриологии не только для получения гаплоидов, но и для изучения проблем морфогенеза. Этому способствует и то, что в сущности в пыльнике находят отражение основные морфогенетические процессы растения в целом (например, чередование поколений). Более глубокое целенаправленное изучение пыльника как модельной системы позволит быстрее разработать способы управления морфогенезом сначала в искусственных, а затем и в естественных условиях обитания растений. Это в первую очередь касается получения гаплоидов. Несмотря на то что пыльник является сложной интегрированной системой, с методической точки зрения пыльник несомненно более простая модель для исследования in situ, in vivo и in vitro, поскольку при изучении пыльника легче выявить и моделировать отдельные морфогенетические процессы и их корреляции. Для более успешного изучения пыльника как модельной системы необходима прежде всего разработка методических основ его изучения: унификация терминологии стадий развития, унифицированное изучение путей морфогенеза при культивировании пыльника у различных видов цветковых растений, отработка вопросов сопряженного изучения всех структур тычинки, пыльника и женской репродуктивной сферы растения и, наконец, рассмотрение основных проблем, затрагиваемых в исследовании и в данном случае связанных с получением гаплоидов. В связи с этим нами разработана определенная стратегия исследования: 1) изучение тычинки in vivo и in vitro в динамике, в сочетании с изучением кинетики биохимических процессов, 2) исследование тычинки в естественных условиях с учетом биологии развития всего растения и особенно антэкологии, 3) изучение тычинки у видов, контрастирующих по способу опыления (например, хазмогамия и клейстогамия), 4) сопоставление фактов, полученных при изучении развития тычинки в естественных условиях и при ее культивировании in vitro, 5) моделирование условий для каждого этапа развития пыльника с учетом данных, полученных в результате комплексных морфофизиологических и генетических исследований.
Предложенный «блок изучения» дает выход на «блок управления», что позволит вскрыть критические периоды (в том числе и оптимальную стадию развития для получения гаплоидов) в развитии тычинки, обусловливающие специфическое развитие отдельных ее структур (микроспоры, пыльцы и т. д.). Все это даст возможность своевременно воздействовать определенными факторами, необходимыми либо для нормального развития пыльника в условиях культуры in vitro, либо для получения гаплоидов и т. д. Введение определенных триггеров в среду при культивировании пыльников на различных этапах их развития у различных видов покрытосеменных позволит выявить морфогенетические потенции различных клеток пыльника, а также пути морфогенеза (эмбриоидогенез, органогенез, гистогенез), по которым пойдет развитие.