Для получения О-антигена необходимо подобрать производственный штамм, приготовить матровую культуру, из которой затем изготовляют сам антиген.
Подбор производственных штаммов. Для изготовления бруцеллезного О-антигена могут быть взяты штаммы бруцелл только в МВБ-форме, т. е. такие штаммы, которые в генерическом коде утратили свойство реверсировать S-антиген бруцелл при любом количестве подкожных пассажей через организм животных или при пересевах (субкультуры).
Штаммы в МВБ-форме перед их отбором для изготовления антигена должны быть однократно апробированы на сохранение свойства О-антигенности и отсутствие свойств S-антигенности. Для этой цели на каждый штамм получают по 2 антисыворотки от кроликов. Для чего двум кроликам массой 3—3,5 кг вводят внутривенно 2 мл микробной взвеси, для приготовления которой к 5 млрд. живых клеток бруцелл двухсуточного роста добавляют 2 мл изотонического раствора хлорида натрия. Через 7 дней инъекцию повторяют. На 10—12-й день после второй инъекции у кроликов берут кровь для исследования по РДСК с S-, О — и OS-антигенами бруцелл.
Антисыворотки обоих кроликов в разведении 1 : 5 и 1 : 10 должны четко реагировать с О — и OS-антигенами для РСК (РДСК), разведенными по титру, и должны быть четко негативными со стандартным бруцеллезным S-антигеном для РСК и РА.
Штаммы, проявившие S-антигенность, не пригодны для изготовления О-антигена.
Приготовление матровых культур. Для засева серии антигена производят предварительную расплодку штаммов в МВБ-форме, описанных выше.
Берут одну пробирку с двух-трехсуточной эталонной культурой, разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия так, чтобы получилась концентрация 10-5, 10-6, 10-7, и засевают в 2 бактериологические чашки с печеночно-глюкозо-глицериновым агаром (ППГГА), внося в них по 0,1 мл каждого разведения. Выращивание культуры производят в проверенных эксикаторах, в которых предварительно сжигают вату или в эксикатор вводят 20% СO2. Через 3—4 сут просматривают культуру на чистоту, определяют типичность роста и морфологию клеток (окраска по Граму).
Из бактериологических чашек отбирают типичные колонии и из них на соответственных средах и при определенных условиях культивирования получают рабочие культуры для засева серии антигена.
Для получения взвеси клеток с целью засева серии антигена необходимо рабочие культуры размножить в нужном количестве в посевных колбах, смыть изотоническим раствором хлорида натрия так, чтобы получилась концентрация 100—120 млрд. микробных тел в 1 мл взвеси по оптическому бактерийному стандарту ГКИ.
Изготовление антигена. Культурой, полученной при расплодке, засевают посевные колбы с ППГГА, увлажняют их посевным материалом и помещают в термостат. Посевы с Br. ovis или с Br. abortus в МВБ-форме помещают в эксикаторы или в большие двухстенные металлические термосы с хорошо пригнанными крышками, снабженными резиновыми прокладками, и завинчивают гайками. Воздух в термосе на 20% заменяют СO2 или внутри него сжигают вату и сразу же закрывают (завинчивают) крышку.
Термосы предварительно выдерживают в термостате сутки с целью создания необходимой температуры между стенками термосов (37— 38° С).
Через 24—36 ч поверхность сред в посевных колбах повторно увлажняют и выдерживают 3—4 сут в тех же условиях.
Через 3—4 сут после посева все культуры в матрасах проверяют на чистоту путем просмотра с рефлектором. Из нескольких колб с чистой культурой делают мазки, окрашивают по Граму и просматривают под микроскопом.
Из чистых матрас удаляют конденсат, затем вводят в них (на площадь 13 X 21 см) 25 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, что позволяет получить взвесь в концентрации 100— 120 млрд. микробных тел в 1 мл взвеси по бактерийному стандарту ГКИ.
Взвесь в указанной концентрации в колбах емкостью 1—2 л прогревают в кипящей водяной бане в течение 2,5 ч или автоклавируют при давлении 1 ат в течение 1 ч. Далее следует четырехкратное замораживание и оттаивание. Взвесь замораживают при температуре —18… —20° С (допускается более низкая, но не более высокая температура), затем ее оттаивают в термостате.
После последнего оттаивания взвесь выдерживают в холодильнике при температуре 0… +4 С в течение 6 сут при периодическом (5—6 раз в день) взбалтывании. Затем ее центрифугируют при 4—5 тыс. об/мин в течение 3,5—4 ч. После центрифугирования надосадочную жидкость, являющуюся антигеном, декантируют, а осадок удаляют.
Надосадочную жидкость (антиген) консервируют путем добавления 0,3% формалина, расфасовывают в стерильных условиях во флаконы.
Титрование О-антигена бруцелл. Титрование О-антигена производят в РДСК по квадратной схеме с 2 позитивными О-сыворотками, одна из них со слабым титром, с позитивными S — и OS-сыворотками и 4 негативными сыворотками.
Нужный титр антигена 1 : 50. Антиген хранят в темном сухом прохладном месте при +8… +12° С. В этих условиях срок годности антигена без перетитровки год.