Многочисленные наблюдения и опыты, проведенные с целью выявления действия субнулевых температур на пойкилотермных животных, опровергли некоторые ранее разработанные общепринятые теории, и в последние годы вся проблема в целом подверглась пересмотру.
Многие исследователи получили данные, что насекомые различных сильно отличающихся друг от друга видов переживают замораживание при низких температурах. Например, Сколендер и сотрудники показали, что личинки комара-звонца (Chironomus), которых обнаруживали на Аляске замерзшими во льду или в иле на дне арктических водоемов при температуре —20°, всегда оживали после оттаивания, даже после замораживания при —40°. Они переживали также неоднократное охлаждение до —16°. Определяли количество льда и воды в этих замороженных, но живых личинках при различных температурах. Отношение содержания воды к сухому весу резко уменьшалось по мере падения температуры. При —15° вымерзало до 90% воды. При —35°, т. е. наиболее низкой температуре, применявшейся в данных исследованиях, в личинке оставалось еще какое-то небольшое количество свободной воды. Иногда личинку переохлаждали, но это не влияло на переживание ею низких температур. С помощью микрометода определяли потребление кислорода частично замороженной личинки при различных температурах. В интервале температур от 0 до —15° у отдельных личинок наблюдалось резкое уменьшение потребления О2. Поразительные изменения коэффициента Q10 для потребления О2 обнаружены в личинках, охлажденных до температур, лежащих выше точки замерзания, а также между точкой замерзания и —5°. Некоторое количество кислорода они потребляли и при —15°, но когда температура падала до —40°, потребность в кислороде сводилась к нулю. В опытах определяли интенсивность диффузии кислорода и СО2 через лед, и она оказывалась достаточной для поддержания дыхания личинок, находившихся в мелких замерзших водоемах при температуре, преобладающей в естественных условиях.
Очень интересное изучение выживаемости замороженных насекомых провел японский ученый Асэхина с сотрудниками. Они сообщили, что предкуколки бабочки Монета flavescens (более известной как Cnidocampa flavescens Walk.) переживали замораживание при —30°, будучи переохлажденными примерно до —20°. Типичная кривая показывает постепенное понижение температуры насекомого во время охлаждения до —20°.
Затем следует резкое и быстрое повышение температуры, совпадающее с наступлением процесса замораживания и обусловленное выделением скрытой теплоты кристаллизации. После этого температура постепенно понижается и достигает уровня температуры окружающего воздуха, тогда как жидкости организма постепенно вымерзают. Когда зимующих предкуколок освобождали от коконов, они переживали замораживание при таких низких температурах, как —30°, что подтвердилось восстановлением у них сокращений сердца после оттаивания. Они переживали также неоднократное замораживание и оттаивание с интервалами в 1 день. Будучи на той же стадии развития, но в интактных коконах, предкуколки переживали и нормально развивались после замораживания и пребывания в течение 100 дней при температуре —15°. В противоположность этому гусеницы, вылупившиеся в летние месяцы, не переживали даже кратковременного замораживания при —10°.
Процесс замораживания зимующих предкуколок Cnidocampa flavescens изучали под микроскопом. Куколкам вскрывали брюшную полость и охлаждали их на столике микроскопа до —10 или —20°. Вымерзание начиналось в нескольких местах с поверхности крови. Постепенно кристаллы разрастались в радиальном направлении, пока не заполняли все пространство, занятое кровью. Когда сердца зимующих предкуколок изолировали и охлаждали в крови непосредственно под микроскопом, кристаллы льда образовывались вне клеток сердечной мышцы. Отдельные клетки и целые органы сморщивались, но после оттаивания они вновь приобретали нормальный вид, а сердечная деятельность восстанавливалась. При таком же замораживании сердец летних гусениц в крови, а также при замораживании сердец зимующих гусениц в 0,15 М растворе хлористого натрия отдельные клетки замораживались изнутри при температуре около —15°. Внутри клеток были видны кристаллы льда, а все сердце в целом темнело. Сердца, в которых происходила внутриклеточная кристаллизация льда, после оттаивания не возобновляли ритмических сокращений. Вполне возможно, что у насекомых, замерзших в естественных зимних условиях, кристаллы льда образовались вне клеток, которые обезвоживались и сморщивались.
В следующих опытах Асахина и Аоки охлаждали зимующих предкуколок Cnidocctmpa flavescens до —90° в специальной холодильной камере, где температура за 1,5 час снижалась от —5 до —90° Спустя 45 мин предкуколок согревали при комнатной температуре, причем из 60 ожило 20. Предкуколок, извлеченных из коконов, погружали в жидкий кислород с температурой —180°. Предварительно их замораживали при —30° и выдерживали при этой температуре в течение одного дня. После оттаивания при комнатной температуре у них восстанавливались сокращения сердца и некоторые предкуколки продолжали развиваться, но не завершали полностью метаморфоза до стадии имаго. Предкуколки, которых до погружения в жидкий кислород выдерживали в течение 1 дня при температуре —10 или —20°, не выживали после оттаивания. Зимующие гусеницы бабочки боярышницы A porta crataegi adherbal Fruhstorfer также переживали погружение в жидкий кислород при условии предварительного замораживания при —30°. После оттаивания у них восстанавливалась нормальная подвижность и они продолжали расти. Можно полагать, что выживание при температуре —180° зависело в каждом отдельном случае от внеклеточного вымерзания воды при —30°.
Еще не выяснены основные факторы, способствующие выживанию этих и других видов насекомых при низких температурах на определенной стадии цикла развития, а также отличие их от насекомых, которые неизбежно погибают при действии замораживания. Новую струю внесли исследования Уайетта и сотрудников, которые установили, что глицерин является основным растворимым компонентом в плазме куколки бабочки Hyalophora cecropia и родственного ей вида сатурнии Telea polyohemus; глицерин обнаружен также в яйцах тутового шелкопряда (Bombyx mori) и в личинках лугового мотылька (Loxostege stictlcalts) и золотарниковой мухи-пестрокрылки (Eurosta solidaglnis). В каждом случае стадия развития насекомого, во время которой в организме находили глицерин, представляла собой зимнюю стадию. Отсюда можно было сделать вывод, что своей устойчивостью к холоду некоторые насекомые обязаны именно накоплению глицерина. Более ранние исследования показывали, что присутствие глицерина в гемолимфе и тканевых жидкостях не всегда связано с устойчивостью к холоду. Солт, например, обнаружил, что личинки лугового мотылька (Loxostege stictlcalts), не переживающие замораживания, имеют почти такую же концентрацию глицерина (2—4%), как и личинки золотарниковой мухи-пестрокрылки (Eurosta solidagints), которые переживают храпение в течение 18 дней при температуре —55°.
Позднее в 1958 г. Солт сообщил, что он нашел до 25% глицерина в зимующих личинках паразитической осы Bracon cephi (Gahan). Некоторые из этих насекомых, паразитирующие на хлебном американском пилильщике (Cephus cinctus), переохлаждались при —47°. Связь между концентрацией глицерина и достигнутой температурой переохлаждения у отдельных личинок показана. Точка замерзания гемолимфы у этих насекомых лежит в интервале от —7 до—17°. Для большей точности результатов были определены также и точки таяния.
Интересно отметить, что концентрация глицерина в личинках Bracon cephi увеличивалась осенью при хранении их как в естественных условиях, так и при температуре —5°. Одновременно с этим понижалась температура переохлаждения и таяния. В, этот же период у насекомых наблюдалась способность переживать воздействие температур от —40 до —47° в переохлажденном состоянии, а также переживать замораживание. Весной и ранним летом происходил обратный процесс — концентрация глицерина в крови понижалась и исчезала устойчивость к холоду. В гемолимфе и других тканевых жидкостях зимующих личинок В. cephi, помимо глицерина, присутствовали также какие-то другие, еще не идентифицированные растворенные вещества. Когда концентрация глицерина достигала 5 М, она не соответствовала наблюдавшемуся в это время понижению температуры таяния примерно на одну моляльную единицу. Не может быть никаких сомнений в том, что исключительная устойчивость личинок В. cephi к холоду в осеннее время связана главным образом с их способностью обеспечивать высокую концентрацию глицерина. Концентрация глицерина в личинках в середине зимы достигала 20—27%, и этого было достаточно для обеспечения переохлаждения до такой низкой температуры, что насекомые не замерзали в своих естественных местах обитания. Концентрация глицерина была также достаточной для защиты отдельных клеток и тканей от повреждения, если личинки В. cephi все-таки замерзали. В чувствительных же к холоду личинках Loxostege sticticalis его концентрация была, видимо, недостаточно высокой для оказания защитного действия. Как бы то ни было, исследования на Bracon cephi показали, что благодаря изменению метаболических процессов с наступлением холодов у ряда насекомых развивалась повышенная устойчивость к холоду. Примечательно, что раньше сам Солт сомневался в существовании такого основного фактора, повышающего устойчивость к холоду.
Впоследствии глицерин обнаружили в зимующих личинках жуков-древоточцев Melandra striata и кукурузного мотылька (Pyrausta nubilalis). Впадающие в спячку пенсильванские муравьи-древоточцы (Camponotus pennsilvanicus) и их яйца содержали зимой 10% глицерина. Когда муравьев, постепенно согревая до комнатной температуры, выводили из состояния спячки, они вновь становились подвижными и приблизительно через 3 дня в их организме уже нельзя было обнаружить глицерина. Как только у насекомых посредством охлаждения вызывали состояние спячки, глицерин вновь появлялся и снова каждый раз исчезал, когда муравьев выводили из этого состояния. Таким образом, нет никаких сомнений в том, что глицерин играет главную роль в устойчивости этих видов насекомых к зимним холодам.
Однако оставалось еще много неясных моментов. Так, например, не известно, откуда берут глицерин личинки Bracon cephi и Camponotus pennsilvanicus в осеннее время. Чино установил, что глицерин и сорбит в находящихся в диапаузе яйцах тутового шелкопряда (Botbyx mori) образуются из гликогена. Уайетт и Мейер полагают, что глицерин является продуктом ферментативного гидролиза глицерофосфатов во время диапаузы у куколок Hyalophora cecropia. Другой невыясненный вопрос касается причины повреждений чувствительных к холоду видов насекомых во время замораживания и оттаивания. Повышение концентрации электролитов, наступающее в процессе вымерзания воды, представляет собой основную причину повреждения эритроцитов и сперматозоидов некоторых видов млекопитающих и, вероятно, различных других клеток в организме млекопитающего. Глицерин в соответствующей концентрации защищает их, по крайней мере частично, действуя как солевой буфер. Однако многие насекомые не так уж богаты электролитами. Глицерин в маленьких количествах может оказывать защитное действие на некоторые липопротеидные компоненты оболочек, находящиеся как внутри, так и вне клеток. Необходимо провести еще много исследований, чтобы выявить роль глицерина в гемолимфе насекомого, в частности в отношении повышения устойчивости к холоду.
Было сделано еще одно важное наблюдение. Крупные клетки жирового тела устойчивой к холоду золотарниковой мухи-пестрокрылки (Eurosta solidaginis) переживают внутриклеточную кристаллизацию льда. Солт изучал процессы замораживания и оттаивания этих клеток непосредственно под микроскопом. Замерзая, они сохраняли свою сферическую форму и первоначальный размер, не сжимаясь, как это обычно бывает с клетками при наступлении внеклеточной кристаллизации. При неоднократном замораживании и оттаивании отдельные капельки жира внутри клеток сливались друг с другом. В естественных условиях зимой клетки жирового тела личинки Е. solidaginis округлялись, а после наступления теплой погоды процесс развития продолжался. Следовательно, можно предположить, что внутриклеточное замораживание и оттаивание представляют собой нормальное явление у этого насекомого на стадии личинки. Так это или нет, но Солт первый наблюдал (причем совершенно отчетливо) выживание живых клеток после внутреннего замораживания. Возможно, различные клетки других холодоустойчивых пойкилотермных животных также переживали внутриклеточную кристаллизацию льда в естественных условиях. Вновь возникает вопрос: всегда ли внутриклеточное замораживание влечет за собой летальный исход?
Давно известно, что многие насекомые для полного развития нуждаются на определенной фазе их жизненного цикла в пребывании в течение какого-то периода времени на холоду. Например, озимая муха (Leplohylemyia. coarctata (Fall.)) откладывает яйца на землю в самое жаркое время года, в июле или августе, а ее личинки вылупляются зимой следующего года, между январем и мартом. Таким образом, они переносят воздействие температур от +30° и выше в августе до —5° и ниже в январе и феврале. Первая стадия развития (морфогенез до диапаузы) протекает при температурах от +3 до +30°. За этим следует диапауза с верхним температурным пределом около +12° и оптимальной, как предполагали ранее, температурой примерно +3°. Уэй установил заметное увеличение длительности диапаузы при —6°, как показало сокращение числа личинок, вылупившихся из яиц через 6, 14 и 34 дня, по сравнению с результатами, полученными, когда яйца инкубировали при +3°. Уэй провел специальный опыт для определения минимальной температуры диапаузы. Яйца, отложенные в середине августа, оставляли в земле, на открытом воздухе, до второй недели ноября, а затем их переносили в сосуды с температурой +3, —6, —18, —22 и —24°. Через определенные промежутки времени яйца извлекали из сосудов и инкубировали при +20°. Регистрировали время вылупления личинок, причем получили неожиданные результаты. При падении температуры ниже —6° диапауза заканчивалась быстрее. Так, из инкубированных при +3° яиц 50% личинок вылупилось через 20 дней, а из инкубированных при температуре —6° — через 45 дней. Однако после воздействия температурой —24° те же 50% личинок вылупилось уже через 6 час, а 88% — через 24 час. При —24° диапауза длилась в 80 раз меньше, чем при общепризнанной ранее оптимальной температуре +3°, и в 180 раз меньше, чем при —6°. Находящиеся в диапаузе яйца повреждались, когда их выдерживали при низких температурах дольше, чем это требовалось для завершения диапаузы. Например, Уэй наблюдал, что после выдерживания при температуре —24° в течение б дней вывелось 98% личинок, а после выдерживания в течение 20 дней — только 32%. После инкубации при температуре —18° в течение 63 дней вылупилось 97%, а после инкубации в течение 206 дней — лишь 36%. Для того чтобы добиться быстрого окончания диапаузы, необходимо было до хранения яиц при —18 или —24° инкубировать их 50—80 дней при +5°. Совершенно ясно, что существуют по крайней мере две фазы в диапаузе. Первая наступает сравнительно быстро при температуре около +5° и может наступить при +20°, но никогда при —18 или —20°. Вторая быстрее всего наступает при температуре от —18 до —24° и может наступить при —5°, но никогда при +20°. Уэй показал, что яйца в диапаузе переохлаждались даже до таких низких температур, как —25 и —28°, и замораживание не было причиной быстрого окончания диапаузы в яйцах, на которых действовали температурой от —18 до —24°. Переохлажденные до —26,5° и затем замороженные яйца при оттаивании оказывались погибшими. До настоящего времени попытки ввести в яйца глицерин терпели неудачу. Еще неясны физиологические процессы, происходящие во время диапаузы, и неизвестны средства, с помощью которых их можно было бы ускорить, используя низкие температуры. Это, по-видимому, один из немногих примеров, когда течение биологического процесса ускоряется за счет понижения температуры животного до —20 или —24°.
Изучая воздействие низких температур на насекомых и другие живые организмы, важно помнить об основных экологических принципах. Мелланби подчеркивает, что при охлаждении насекомых их возможное переживание и смерть не является ни единственным, ни даже самым важным фактором, которые следует иметь в виду. Выживание вида зависит от многих сторон активности, связанных с жизненным циклом, в том числе от питания и способности размножаться. Выживаемость же отдельной особи связана с ее способностью избегать непосредственно угрожающей ей опасности. Так, например, личинки желто-лихорадочного комара (Aedes aegypti) обычно находятся у поверхности воды, но немедленно уходят на дно, как только их встревожит появление какой-либо тени или сотрясение воды. Реакция тревоги исчезает при охлаждении воды до 9—14° (в зависимости от того, к какой температуре привыкли личинки). Последующее охлаждение приводит к тому, что личинки становятся неподвижными, хотя они еще в состоянии реагировать на механическое раздражение. Затем достигается температура Холодовой комы, а при дальнейшем понижении температуры насекомые уже находятся в состоянии холодового наркоза. Показано действие акклиматизации при различных температурах на личинки A. aegypti у согретых после Холодовой комы и оживших личинок восстанавливается реакция тревоги.
Многие насекомые погибают при температурах выше нуля. Личинки комара А. aegypti, например, погибают при +0,5° через различные сроки в зависимости от температуры, при которой они раньше жили. Все личинки, культивированные при +30°, погибали менее чем через 17 час при температуре +0,5°. Если же их предварительно выдерживали при температуре 17°, они переживали такой срок хранения при +0,5°. Через 18 час наступала полная акклиматизация к окружающей холодной среде при условии, что температура была все же выше, чем та, при которой наступает холодовая кома.
В отношении некоторых насекомых можно добиться того, что они привыкнут к действию низких температур, бывших ранее летальными. Так, пребывание при относительно высокой температуре +15° помогает черным тараканам (Blatta orientalis) переживать кратковременное пребывание при такой низкой температуре, как —6,8°, которая детальна для насекомых этого вида, предварительно инкубированных при +30°. Механизм такой быстрой акклиматизации еще не известен, но вряд ли можно сомневаться в наличии приспособительных изменений во всех тканях активного насекомого в ответ на колебания температуры. Насекомые, впадающие под влиянием холода в состояние наркоза, не акклиматизируются. Более того, они подвергаются опасности быть уничтоженными другими животными или различными механическими и физическими силами, помимо самого замерзания. Замерзание не всегда является главной причиной гибели охлажденных насекомых. Для выживания многих видов существенное значение имеет продолжительное пребывание их ежегодно при температуре значительно выше нуля.