К настоящему времени изолировано около 2000 ферментов из различных растительных и животных объектов, в том числе и микроорганизмов. Многие из них не только катализируют биохимические реакции, протекающие в данном организме, но и играют важную роль в технологии переработки пищевых продуктов растительного и животного происхождения. С ферментативными реакциями связано размягчение плодов и овощей в результате протекающих в них метаболических процессов, регулируемых собственными, естественно содержащимися в них ферментами. Нежелательное потемнение многих плодов и овощей после разваривания или повреждения паренхиматических тканей тоже обусловлено ферментативными процессами. Аналогичен и случай с автолизом мяса. В некоторых случаях ферментативные изменения связаны с экзоферментами, выделяемыми микроорганизмами, которые развиваются в данном пищевом продукте или на нем. В сущности ферменты являются одним из основных факторов, вызывающих разваривание пищевых продуктов или понижение их пищевой ценности. Другие основные факторы — это микроорганизмы и химические реакции. В этом аспекте ферменты являются одной из основных проблем технологии переработки и консервирования пищевых продуктов.
Кроме этой негативной стороны, ферменты играют важную роль в отношении качества сырья и готового продукта, в получении различного ассортимента пищевых продуктов, повышении пищевой ценности продуктов и т. д. В качестве примеров можно указать на улучшение качества некоторых плодов (например, груш) при их регулируемом дозревании, улучшение качества мяса в результате его автолиза, осветление соков и др. Все это определяет большую технологическую значимость ферментативных реакций при переработке и консервировании плодов, овощей, мяса, рыбы, молока и т. д. Вот почему современная технология включает процессы, при которых употребляются различные ферментные препараты в зависимости от вида сырья и готового продукта.
Для регулирования технологических процессов необходимо располагать сведениями об активности ферментных препаратов. Количественно активность ферментов, в том числе ферментных препаратов, определяется по скорости ферментативной реакции. Активность эта — не абсолютная, а условная величина, полученная при определенных опытных условиях — температуре, концентрации субстрата, pH реакционной среды, времени с начала проведения реакции, биохимическом составе среды и т. д.
За единицу активности принимают то количество фермента или ферментного препарата, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при принятых опытных условиях.
Когда количество субстрата нельзя определить в микромолях, так как не известна его молекулярная масса (белки, крахмал, пектин, целлюлоза и т. д.), учитывают полученные действием фермента реакционные единицы, например, число свободных СООН-групп при гидролизе белков, дающее указание о числе разорванных пептидных связей, числе гидролизованных глюкозидных связей при гидролизе крахмала, целлюлозы, пектина и т. д.
Содержание фермента в соответствующем ферментном препарате выражается стандартными единицами активности фермента в 1 см3 ферментного препарата, если он жидкий, или в 1 г препарата, если он сухой. Активность его выражается в микромолях реагировавшего субстрата, например сахарозы, под действием 1 см3 или 1 г препарата за 1 мин при принятых стандартных условиях. Число стандартных единиц равно числу реагировавших микромолей субстрата.
Если ферментный препарат гомогенный, его относительная активность может выражаться в стандартных единицах на 1 мг препарата. Если, однако, в препарате имеются балластные вещества, содержащие неактивный белок, относительная активность ферментного препарата выражается в стандартных единицах на 1 мг общего белка, содержащегося в ферментном препарате.
Молярная активность ферментных препаратов представляет собой число миллимолей субстрата (например, сахарозы) или миллиэквивалентных реактивных групп (NH2, СООН, СНО и т. д.), освобожденных от препарата, соответственно затронутых или освобожденных через 1 мин под действием 1 ммоль фермента при оптимальной концентрации субстрата. Молярная активность выражается также числом стандартных единиц, соответствующих 1 ммоль фермента, если известна молекулярная масса фермента.
Ферментные препараты характеризуются тем, что кроме активного ферментативного белка содержат различные балластные вещества, в том числе и инертные белки. Помимо этого, часто ферментные препараты содержат не один, а два и больше ферментов. При определении названия препарата во внимание принимается лишь основной фермент. По этой причине название ферментным препаратам дается довольно произвольно.
Ферменты, применяемые в консервной промышленности
Ферменты в консервной промышленности применяются преимущественно при производстве плодовых и овощных соков. Они используются с целью увеличения выхода сока, производства осветленных соков, понижения интенсивности окислительных процессов при хранении соков и консервированных плодов и овощей, инвертирования сахарозы и т. д.
Для увеличения выхода сока используются ферментные комплексы, содержащие протеолитические, пектолитические, гемицеллюлазные и целлюлазные составляющие, а в некоторых случаях и амилазные (если в сырье содержится крахмал).
В настоящее время прмята следующая номенклатура пектолитических ферментов:
- пектинэстераза (ПЭ) гидролизует эфирные связи метилового спирта, и последний выделяется в свободном состоянии. Действует лучше, если соседний галактозидный остаток не этерифицирован, а содержит СООН;
- эндополиметилгалактуроназа (эндо-ПМГ) разрывает цепь пектина произвольно по длине, причем соседние галактуроназные остатки должны быть метилированными. Она как бы фрагментирует молекулу пектина и пектиновой кислоты;
- экзополиметилгалактуроназа (экзо-ПМГ) разрывает лишь крайние α-1,4-связи, т. е. отщепляет только крайние галактозные кольца, или, как принято говорить, осахаривает пектин, потому что формирует свободный сахар (галактозу). Действует лишь при условии, если оба соседних галактозных кольца (крайний и находящийся рядом с ним) метилированы (этерифицированы);
- эндополигалактуроназа (эндо-ПГ) фрагментирует полигалактуроновую (пектовую) кислоту и слабо этерифицированную полигалактуроновую кислоту, называемую еще пектиновой кислотой. Разрывает связь между двумя соседними неэтерифицированными галактозными кольцами;
- экзополигалактуроназа (экзо-ПГ) осахаривает крайние галактозные кольца, если они и рядом находящиеся неэтерифицированы;
- трансэлиминазы разрывают негидролитическим путем пектиновые вещества с образованием двойной связи в галактуроновом остатке между четвертым и пятым атомами углерода. Полученные продукты негидролитического расщепления пектиновых веществ имеют сильную абсорбцию при 235 нм и дают окрашенные вещества с тиобарбитуровой кислотой (поглощаются при 547 нм). На базе их субстратной специфичности трансэлиминазы делятся на эндопектинтрансэлиминазу (эндо-ПТЭ), экзопектинтрансэлиминазу (экзо-ПТЭ), эндополигалактуроназотрансэлиминазу (эндо-ПГТЭ) и экзополигалактуроназотрансэлиминазу (экзо-ПГТ), аналогично полигалактуроназам и полиметилгалактуроназам.
Состав подходящего для этой цели ферментативного комплекса должен удовлетворять определенным требованиям, учитывая и цвет плодов. С точки зрения цвета плоды делятся на две группы — слабоокрашенные (яблоки, айва, груши, белый виноград) и сильноокрашенные красные плоды (вишня, малина, земляника, смородина, красный виноград и т. д.). Комплекс ферментов для первой группы плодов должен содержать пектинэстеразу, эндополигалактуроназу, эндополиметилгалактуроназу. Желательно, содержание протеиназ, экзополигалактуроназы, гемицеллюлазы и целлюлазы. Нежелательно наличие пектинтрансэлиминазы, аскорбатоксидазы, антоцианоксидазы. Недопустимо наличие пероксидазы, полифенолоксидазы и каталазы.
Комплекс ферментов для второй группы плодов должен содержать пектинэстеразу, эндополигалактуроназу и пектинтрансэлиминазу. Желательно содержание аналогичных ферментов, нужных для первой группы плодов. Нежелательно наличие пероксидазы, полифенолоксидазы и каталазы. Недопустимо присутствие антоцианоксидазы и аскорбиназы.
При обработке мезги из первой группы плодов для производства осветленных соков эндо-ПГ и экзо-ПМГ, а также пектинэстераза способствуют резкому понижению вязкости полученного сока. Протеиназа, экзо-ПГ, целлюлаза и гемицеллюлаза повышают проницаемость клеточных стенок, способствуя увеличению выхода сока. Наличие пектинтрансэлиминазы нежелательно, потому что катализирует разложение нерастворимого пектина и активизирует мацерацию плодовой ткани, а это ухудшает дренажные свойства плодовой мезги. Окислительные ферменты ухудшают цвет.
При производстве соков с мякостью (нектаров), наоборот, желательно наличие мацерирующих ферментов, но нежелательно присутствие эндополигалактуроназы, которая понижает вязкость жидкой фазы и ускоряет расслоение нектара. При производстве этих соков определяющую роль играют пектинтрансэлиминаза, гемицеллюлаза и целлюлаза. Пектинтрансэлиминаза способствует превращению протопектина в пектин, а целлюлаза и гемицеллюлаза улучшают консистенцию соков. Полигалактуроназа и особенно эндополигалактуроназа нежелательны, потому что уменьшают вязкость и гемогенность.
Максимальная сокоотдача и хорошее осветление, а также наиболее низкая вязкость отжатого после прессования сока получаются под действием эндо-ПГ и эндо-ПМГ. Вот почему при определении условий лучшей обработки ферментами наблюдается прежде всего эффект двух ферментов. Чем выше степень этерификации пектина, тем больше вязкость сока и тем слабее будет эффективность эндо-ПГ, а выше эффективность эндо-ПМГ. Это связано с тем, что высокоэтерифицированный пектин незначительно гидролизуется эндополигалактуроназой, а больше — эндополиметилгалактуроназой. Деэтерифицированный пектин, называемый еще пектовой кислотой, гидролизуется под влиянием эндополигалактуроназы примерно в 60 раз быстрее высокоэтерифицированного (более 70%) пектина и в 17 раз быстрее частично этерифицированного пектина, называемого еще пектиновой кислотой.
Дубильные вещества отрицательно влияют на пектолитические ферменты, но и сами изменяются под действием ферментов. Ингибирующий эффект на них оказывает лимонная кислота, а полигалактуроназа чувствительна к фенольным соединениям, и особенно к окисленным лейкоантоцианам и катехинам. На действие пектолитических ферментов влияние оказывают pH, минеральный и биохимический состав и др.
Расщепление пектиновых веществ происходит под действием двух групп пектолитических ферментов — гидролитических (эндо-ПГ, экзо-ПГ и эндо-ПМГ) и ферментов липазного типа, разрывающих α-1,4-связи и образующих ненасыщенные мономерные дериваты галактуроновой кислоты (эндо-ПТЭ, экзо-ПТЭ, эндо-ПГТЭ и экзо-ПГТЭ). Обычно трансэлиминазы имеют оптимум действия в нейтральном pH, поэтому в нормальных условиях они оказывают слабое влияние, но все-таки способствуют мацерации тканей плодов и овощей. Вот почему для изменения пектиновых веществ значение имеют прежде всего гидролазы и особенно при производстве осветленных соков.
Выпускаемые в настоящее время пектолитические препараты обычно являются полиферментами и их ферментный состав в количественном и качественном отношении зависит от продуцента (микроорганизма) и условий получения. По этой причине для каждого препарата необходимо предварительно установить оптимальные условия его использования для данного сырья. Кроме того, нельзя забывать о том, что сырье тоже содержит пектолитические ферменты.
У яблок, груш и айвы под влиянием пектинэстераз и полигалактуроназ разрушается растворимый пектин, вязкость клеточного сока понижается, выход сока увеличивается. Если, однако, ферментный препарат содержит пектинтрансамилазу и другие мацерирующие ферменты, часть нерастворимых пектиновых веществ переходит в растворимые формы. Это приводит к повышению вязкости клеточного сока и соответствующему понижению выхода сока.
Для нежных плодов (земляники, малины, смородины и т. д.) характерно следующее. Под влиянием пектолитических ферментов быстро нарастает проницаемость клеточных стенок, нарушается целостность самих клеток, вязкость сока падает, а выход увеличивается на 20%. Это увеличение получается, если продолжительность обработки ферментным препаратом составляет 3—4 ч. Если продолжительность превышает указанную, выход сока задерживается на уровне, полученном через 3—4 ч.
Для черешни, вишни и винограда, у которых окрашена лишь кожица, обработка ферментами должна обеспечить мацерацию не только мякоти, но и кожицы, для того чтобы могли экстрагироваться и антоцианы, содержащиеся в них. Трехчасовой обработки обычно бывает достаточно. За это время выход сока, например, из винограда, повышается на 5—7%.
Для некоторых косточковых плодов (слив, абрикосов, персиков и др.), когда они созрели, обработка ферментами обязательна в целях понижения вязкости сока. При этом выход сока повышается на 12—20%, достигая 50—55%.
При обработке ферментами с целью повышения выхода наблюдаются и нежелательные изменения цвета и вкуса. Особенно неблагоприятно действие окислительных ферментов, содержащихся как в препаратах, так и в самом сырье. Вот почему перед обработкой ферментами рекомендуется бланшировать сливы, черные сорта винограда и другие плоды. Термическая обработка яблок, айвы, белых сортов винограда исключена. Вместо нее используются химические агенты, которые, однако, не должны мешать гидролитическим ферментативным процессам. Чаще всего применяют SO2, сорбиновую кислоту, бензоат натрия, аскорбиновую кислоту и др. В противном случае в течение 3—4-часовой обработки ферментами окислительные ферменты сильно ухудшают качество полученного сока.
Комбинация из глюкозооксидазы и каталазы, прибавленных к сокам и компотам перед герметизацией банок, понижает окислительные реакции, а следовательно, и нежелательные изменения цвета продукта. Прибавленная глюкозооксидаза окисляет глюкозу (а не другие биологически активные компоненты, например аскорбиновую кислоту) до глюконовой кислоты и выделяется пероксид водорода. Последний под действием каталазы разлагается на воду и кислород. Кислород, однако, выделяется в меньшем количестве по сравнению с израсходованным на окисление глюкозы. В результате этого баланса достигается постепенное понижение содержания кислорода, содержащегося в упаковке, и этим предотвращаются нежелательные окислительные изменения.
Протеолитические ферментные препараты понижают содержание белков в осветленных соках и этим предотвращают их помутнение на белковой основе.
Фермент нарингиназа используется при производстве соков из цитрусовых плодов с целью разрушения нарингина (7-рамнозидо-β-глюкозидо-4,5,7-тригндроксифлавонон), придающего соку горький вкус. Пектолитические препараты также гидролизуют нарингин по аналогичному механизму (и здесь образуются прунин и нарингинин, которые не горькие), но в меньшей степени, примерно около 50%, пока длится процесс осветления пектолитическими ферментными препаратами.
Иммобилизованные ферменты
При классических методах ферментативной обработки сырья ферменты используют «однократно», так как они остаются в продукте или инактивируются. Однократное их применение ограничивает процессы, протекающие под их влиянием. По этой причине созданы новые формы ферментных препаратов, используемых многократно. Они известны под названием иммобилизованных, связанных, фиксированных, матрицированных и т. д., но чаще всего применяется термин иммобилизованные ферменты.
Для иммобилизирования ферментов используют разнообразные носители неорганического и органического происхождения. К носителям предъявляются определенные требования — не растворяться в среде, которая будет обрабатываться ферментом, отличаться по электрическому заряду от заряда фермента, обладать высокой химической, биологической и механической устойчивостью, не проявлять неспецифической адсорбции к компонентам продукта, который обрабатывается, иметь высокую гидрофильность, не вызывать конформационных изменений в молекулах белках фермента и других белков, содержащихся в обрабатываемом продукте, легко поддаваться гранулированию и активизации. Могут иметь форму зерен, волокон, колец или трубок и т. д.
Органические носители — полимеры природного и синтетического характера. К полимерам природного происхождения относятся полисахариды и белковые носители в качестве дериватов целлюлозы, декстрина, крахмала (амилазы и амилопектина), агаразы и т. д. Белки используются очень редко.
В качестве синтетических полимерных носителей используют полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные дериваты.
Наиболее перспективными неорганическими носителями являются микропористые силикагель, аэросилогели (силохромы), пористое стекло и др.
Процесс самой иммобилизации фермента тесно связан с его структурой и с особенностями носителя. Для иммобилизации ферментов большое значение имеют сущность активных функциональных групп их белков и реакции, которые они реализуют.
Используются так называемые агенты, служащие для активирования полимерных носителей и для связывания белка фермента с носителем.
Все способы связывания ферментов делятся на две группы: без образования ковалентных связей между белком и матрицей (это так называемые физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентных связей (химические методы иммобилизации). В настоящее время химические методы являются основными. Полученные посредством них препараты являются стабильными, ферменты не «отмываются» от носителя, понижено отрицательное действие матрицы на сам фермент. Существенным недостатком является частичная инактивация фермента, который иммобилизован.
Современное направление — иммобилизация целых микробных клеток и их использование для осуществления соответствующих ферментных реакций.
Установлено, что иммобилизованные ферменты отличаются по свойствам от нативных ферментов, так как в известной степени изменяется пространственная структура ферментной белковой молекулы. Вот почему в большинстве случаев иммобилизация понижает активность фермента. В то же время, однако, очень часто иммобилизация приводит к расширению границ температуры и pH, более эффективному действию ферментов, а это является большим преимуществом. Кроме того, энергия активации ферментативных реакций сохраняется и понижается отрицательное влияние ингибиторов.
Проведен ряд успешных опытов по иммобилизации ферментов, применяемых при осветлении плодовых соков.
Источник: Б.Л. Флауменбаум, С.С. Танчев, М.А. Гришин. Основы консервирования пищевых продуктов. Агропромиздат. Москва. 1986