Методические приемы исследования микрофлоры почвы чрезвычайно разнообразны и в данном очерке может быть дан лишь краткий обзор их принципов.
До 30-х годов в почвенной микробиологии господствовал метод «микробиологических реакций», при котором химически учитывался лишь конечный продукт трансформации микробами почвы того или иного соединения. Возбудителей процесса исследователь при этом не изучал. Этот метод широко использовался, в частности, С. П. Костычевым в созданном им Институте сельскохозяйственной микробиологии ВАСХНИЛ. Были получены некоторые интересные результаты. Так, было показано, что по направлению с севера на юг возрастает интенсивность мобилизационных процессов. Однако для Костычева было очевидно, что анализ почвы следует строить на выявлении специфики узких групп или видов микроорганизмов. В одной из своих последних работ (1930) он отмечал, что это трудный, но плодотворный путь.
Для диагностики группового и частично видового состава микронаселения почвы давно используется метод посева на различные твердые и жидкие питательные среды. Из твердых питательных сред наиболее часто используются мясо-пептонный агар (МПА), крахмало-аммиачный агар (КАА), подкисленный сусловый агар (СА) и ряд других сред с различными источниками азота и углерода. Агар может быть заменен желатиной. Иногда используют кремнекислый гель, который может быть пропитан различными органическими или минеральными соединениями. В последнем случае можно учесть наличие в почве автотрофных микроорганизмов.
На плотные среды обычно высевают почвенную болтушку. Можно, однако, рассевать мелкие почвенные частицы или раскладывать мелкие комочки почвы.
Почва представляет собой сложную многофакторную систему, в которой имеются микрозоны с различной концентрацией органических и минеральных веществ. Зоны распада растительных и животных тканей богаты органическими соединениями и их микрофлора может быть выявлена на относительно богатых субстратах. Определенные группировки этой микрофлоры выявляются с помощью таких сред, как МПА, КАА, СА и т. д. На этих средах можно примерно учесть численность ряда групп микроорганизмов, а также отдельных их видов. Некоторые представители данного ценоза требуют наличия в среде даже кровяной плазмы. Группировка микробов, активно различающая растительные и животные остатки, отнесена Виноградским к «зимогенной» микрофлоре.
Конечно, в почве не менее обычны зоны, бедные органическими веществами, где могут существовать олигокарбофильные и олигонитрофильные микроорганизмы. Для их учета нужны среды с низкой концентрацией питательных органических соединений. Следует предположить, что отмеченная группировка завершает разрушение органических веществ в почве. Она может быть расценена как сателлитная. Г. А. Заварзин предложил назвать ее «микрофлорой рассеяния».
Учет ряда физиологических группировок микроорганизмов производится на жидких питательных средах, содержащих набор минеральных и органических соединений. Таким способом выявляют наличие аммонификаторов, денитрификаторов, разлагающих клетчатку микробов, и т. д. Используя минеральные среды, можно учесть также численность разных группировок автотрофных микроорганизмов. Работая с жидкими средами, обычно применяют метод титра.
Методы посева и титра имеют ряд моментов, делающих их показания условными, определяющими скорее порядок численности микроорганизмов, а не точное количество тех или иных организмов. Прежде всего многие микроорганизмы довольно сильно адсорбированы почвенными частицами. Поэтому целесообразно при приготовлении почвенной суспензии применять те или иные методы, вызывающие десорбцию микробов. С этой целью используется обработка почвы пирофосфатом натрия или поверхностно активными веществами, воздействие ультразвуком, растирание почвенных образцов и т. д. Подобная обработка, в зависимости от типа почвы, увеличивает показатели в 2—10 и более раз.
Микроорганизмы могут адсорбироваться на стенках стеклянной посуды, используемой для анализа. Для борьбы с этим явлением не разработаны какие-либо подходы.
Колонии, вырастающие на твердых питательных средах, могут происходить из одной или группы клеток микроорганизмов и т. к. в случае грибов и актиномицетов остается неясным, из какой величины обрывков мицелия или из спор вырастают колонии. Все это считается продукцией какой-то «условной клетки» (образующей колонию единицы).
Все отмеченное, как уже указывалось, побуждает расценивать показания методов посева и титра далеко не абсолютными, но все же условно отражающими реальную действительность.
Необходимо учитывать большую пестроту плотности микронаселения в отдельных зонах почвы. Поэтому даже одновременно взятые с поля пробы почвы показывают весьма существенные расхождения в численности микронаселения. Отдельные пробы почвы имеют весьма различную численность микробного населения. Поэтому для анализа рекомендуется брать среднюю пробу почвы из значительного числа точек (около 10). Из этой средней пробы надо брать навеску для анализа.
Ряд исследователей придерживаются того мнения, что почвенные микробиологи используют для выявления состава микроорганизмов почвы неудачные среды. Например, Д. И. Никитин считает, что метод разливок на обычные среды был механически заимствован из медицины и чужд почвенной микробиологии. С этим, конечно, нельзя согласиться. Если логично развивать выше высказанное сомнение, то следует заключить, что и медицинские микробиологи более чем неосмотрительно применяют, например, пептонные или сахарные среды, так как изучаемые ими организм человека и другие объекты не состоят из пептона, сахара, некоторых минеральных соединений и воды. Непонятно тогда, почему столь, казалось бы, необоснованный подход медиков к работе определил получение важнейших теоретических и практических результатов. Конечно, неправильно думать, что на МПА, КАА или какой-то другой среде вырастают все почвенные микроорганизмы. В каждом отдельном случае выявляется какая-то частная группировка микробов.
Целесообразно отметить, что один из ведущих микробиологов нашей страны — А. А. Имшенецкий после проведения экспериментальной работы, пришел к выводу, что лучшей средой для учета почвенной микрофлоры является печеночный экстракт. Данная среда рекомендуется им даже для выявления бактерий на планетах. Конечно, это не исключает использование для определенных целей специальных сред.
Вряд ли кто-либо из почвенных микробиологов полностью удовлетворен существующими методическими приемами. Их следует улучшать и расширять. Полезно напомнить, что ограниченные возможности стандартных методов отмечал еще в прошлом веке С. Н. Виноградский. В работе «О роли микробов в общем круговороте жизни» (1897) он писал: «…и если уже теперь… при некотором однообразии приемов исследования, нашли столько видов в такой короткий срок, то что же будет дальше? Если и теперь всякий еще «не изданный» прием исследования немедленно вознаграждается открытием новых важных видов, то чего же мы можем ожидать в будущем?»
На самом же деле опыт показывает, что введение в практику сред нового состава раскрывает более широкие возможности в познании микронаселения почвы. Например, применение бедных агаризованных сред позволило установить наличие в почве большого числа представителей рода Nocardia, которые не выявляются на обычных средах. Значительно больше микроорганизмов, чем на мясо-пептонном агаре, вырастает на агаре, приготовленном с почвенным экстрактом, или на агаризованной почве.
Д. И. Никитину с соавторами, Л. В. Васильевой и другим исследователям удалось, используя среды, содержащие пониженные концентрации питательных органических веществ, перегнойные соединения или агаризованную почву, изолировать группу интересных почвенных микроорганизмов — Agrobacterium polyspheroidum, Renobacter vacuolatum, Stella humosa и т. д. Подобные микроорганизмы не выделяются на обычных питательных средах, но они хорошо растут на средах с меньшей концентрацией органических веществ. Автору настоящей работы удалось подобрать питательную среду, на которой легко дифференцируется видовой состав бацилл. Конечно, могут быть рекомендованы и другие, ценные для анализа почвенной микрофлоры среды.
Наиболее характерными образованиями почв являются перегнойные (гумусовые) вещества. Эти сложные полициклические соединения накапливаются в почве при распаде растительных остатков. Микрофлору, принимающую участие в разрушении перегноя, Виноградский выделял в особую группировку, названную им «автохтонной». Компоненты этой группировки могут быть выявлены на твердых или жидких питательных средах, содержащих в качестве единственного источника органического вещества гуминовую кислоту или другие соединения из группы перегноя.
Для познания почвенной микрофлоры многое дают прямые методы микроскопирования почвы. Впервые данный метод был предложен Виноградским. Микроскопирование изменило наши представления о численном составе микронаселения почвы. Бели методы разливок и титра учитывали в 1 г почвы несколько миллионов микроорганизмов, то прямой подсчет под оптическим микроскопом повысил этот показатель до нескольких миллиардов. Позднее метод прямого микроскопирования был модифицирован О. Г. Шульгиной. В дальнейшем его стали использовать с флюорохромом, акридином оранжевым, что облегчило диагностику микроорганизмов.
Крупным достижением общей и почвенной микробиологии явился метод капиллярной микроскопии, предложенный Б. В. Перфильевым и Д. Р. Габе. Была разработана технология приготовления капиллярных приборов разного назначения. Капиллярная микроскопия позволяет изучать микробные пейзажи почвы, производить подсчет микробных клеток в почве и других субстратах, а также выделять чистые культуры из одной клетки.
Во многих работах прямое микроскопирование почвенных суспензий было использовано для установления численности и динамики микроорганизмов, а также для определения биомассы микробов в почве. По примерным подсчетам она достигает 5—7 т/га в расчете на сухое вещество.
Весьма интересные данные были получены при прямом анализе почв с помощью электронного микроскопа. Удалось обнаружить большое разнообразие неизвестных ранее форм микробов. По сравнению с показаниями прямого метода Виноградского общая численность микроорганизмов почвы возросла еще на 1—2 порядка. Отмеченное увеличение происходит в основном за счет весьма мелких форм микроорганизмов и поэтому общие представления о биомассе микроорганизмов в почве существенно не меняются. Вообще же, поскольку при микроскопии учитываются как живые, так и мертвые клетки многих групп микроорганизмов, не растущие на используемых сейчас средах, то получение более высоких показателей при этом методе работы не вызывает удивления.
Прямые методы анализа почвы не позволяют судить о функциях тех или иных микроорганизмов в почве. Для этого требуется изолирование чистых культур микроорганизмов.
Количественное определение микроорганизмов в почве любыми способами не дает никакого представления об их топографии и взаимоотношениях в почвенном слое.
Анализ естественного состояния микроорганизмов в почвенном слое можно сделать методом отпечатков, рекомендованным Н. Г. Холодным. В некоторых случаях возможно применение вариантов этого метода.
Большие возможности дают капиллярные педоскопы Перфильева и Габе (1961), широко использованные для выявления микробных пейзажей Аристовской (1963), Паринкиной (1968) и другими исследователями. Рекомендованы и другие приемы исследования. Так, например, Баргес советует заливать почвенные блоки смолами и на тонких шлифах анализировать распределение в почве микроорганизмов.
Сделанный обзор показывает, что методические приемы у почвенных микробиологов весьма разнообразны. При решении частных вопросов, очевидно, нецелесообразно пользоваться всем набором существующих приемов исследования и следует выбирать методы, наиболее подходящие для данного конкретного случая.
В дополнение к микробиологическим показателям суммарный эффект мобилизационных процессов в почве может быть определен такими показателями, как нитрификационная способность почвы, ее дыхание, а также применением аппликационного теста.