В естественных условиях энтомопатогенные вирусы попадают в организм насекомого, как правило, вместе с кормом.
Не исключен и парэнтеральный путь заражения при микротравмах личинок, которые происходят особенно часто у хвоегрызущих видов насекомых. Возбудители вирусных болезней могут проникать в гемолимфу и в результате деятельности паразитов и хищников.
В исследованиях последних лет показаны пути внедрения вирусов ядерного полиэдроза и гранулеза в эпителий кишечника личинок чешуекрылых насекомых и начальные этапы размножения. В просвете кишечника нуклеокапсиды, освободившиеся из телец-включений, проникают в цилиндрические клетки. При этом уже в течение первых 2 ч после заражения вирионы прикрецляются к микроворсинкам клеток, и вирион без наружной оболочки проникает в микровырост, а затем в цитоплазму; в ядро через поры ядерной мембраны попадает содержание нуклеокапсида, где происходит первая репликация палочковидных вирусов. Сформировавшиеся вирионы освобождаются из ядра, попадают в цитоплазматические вакуоли, затем переносятся к базальной мембране и выходят в гемоцель. Вирионы могут распадаться непосредственно в просвете кишечника на субвирусные частицы, которые и проникают в гемолимфу. Инфекционность субвирусных частиц доказана специальными экспериментами.
При ядерных и цитоплазматических полиэдрозах всех типов и при гранулезах клетки кишечного эпителия насекомых служат местом первого репродукционного цикла вирусов. Включения в этих клетках при ядерных полиэдрозах и гранулезах, как правило, не образуются. Однако возбудители могут через эпителий кишечника проникать во все органы и ткани с током гемолимфы. Возможность дальнейшего продуктивного взаимодействия вирусов с клетками различных тканей зависит от их взаимного сродства.
Проведены специальные исследования экспериментально полученного патологического материала с целью изучения динамики развития гранулезной инфекции и уточнения места локализации включений в инфицированной клетке. Динамика ядерного полиэдроза прослежена у гусениц непарного шелкопряда и туркестанской златогузки, а также у ложногусениц рыжего соснового и тополевого (осинового) волосатого пилильщиков при ядерных полиэдрозах кишечного типа, характерных для перепончатокрылых насекомых. Особое внимание уделено развитию гранулезной инфекции как наименее изученной.
Применение для обнаружения возбудителя гранулеза высокочувствительного метода флуоресцирующих антител позволило установить, что при пероральном введении высоковирулентных гранул гусеницам хохлатки-отшельницы специфическое свечение возникает через 24 ч после попадания гранул в пищеварительный тракт в околоядерной зоне цитоплазмы клеток жирового тела. Параллельный просмотр гистологических срезов, окрашенных гематоксилинэозином по Фёльгену и Браше, в обычном световом микроскопе не выявляет каких-либо специфических морфологических изменений в клетках.
Специфический антиген в гиподерме удается обнаружить через 48 ч после заражения гусениц. С течением времени интенсивность свечения околоядерных зон в клетках жирового тела и гиподермы увеличивается. Параллельно возникают очаги люминесценции в клетках эпителия трахеального матрикса и макронуклеоцитах. Антигены включений выявляются в виде широких ярко люминесцирующих зон по периферии и в околоядерных участках цитоплазмы. На конечных этапах инфекционного процесса в тканях можно наблюдать клетки, находящиеся на различных стадиях патологии. Отдельные клетки теряют цитоплазму, а ядра, увеличенные в 2—6 раз, разрыхляются и в некоторых случаях люминесцируют сплошными пятнами. Свечение околоядерных зон обнаруживается также в клетках эпителия трахей и некоторых форм гемоцитов — макронуклеоцитов, фагоцитов и микронуклеоцитов. Таким образом, включения формируются прежде всего в клетках жирового тела. В дальнейшем вирусный антиген появляется последовательно в клетках гиподермы, трахеального матрикса и гемоцитах.
Применение флуоресцирующих антител позволило установить, что при алиментарном заражении гусениц первые признаки люминесценции комплекса антиген-антител в гемоцитах наблюдаются через 48 ч с момента попадания гранул в пищеварительный тракт. Слабое свечение начинает проявляться дисперсно в цитоплазме гемоцитов. Еще через 24 ч в околоядерных участках клеток обнаруживаются интенсивно люминесцирующие зоны. В этот период присутствие гранул в клетках с помощью обычных гистологических методов не обнаруживается. В острой фазе инфекционного процесса оболочка клеток частично или полностью разрушается, свечение распространяется по всей цитоплазме; в некоторых случаях наблюдается также свечение гипертрофированного ядрышка. Появление специфического свечения форменных элементов крови до выхода в плазму сформировавшихся гранул после разрушения клеток жирового тела говорит о размножении вируса в гемоцитах.
При субкутальном введении гусеницам инфекционного материала обнаруживается агглютинация гранул. Затем конгломераты включений, абсорбированные поверхностью гемоцитов, исчезают, и свечение распространяется дисперсно на всю цито плазму. Агглютинация гранул и их абсорбция гемоцитами происходят в первые 2 ч после введения инфекта в тело насекомого. Через 24 ч интенсивно люминесцирующие зоны отмечаются в околоядерных областях клеток, и дальнейший процесс нарастания патологических измений протекает так же, как и в случае алиментарного заражения. Интенсивно разрушаются ядра клеток жирового тела, затем гиподермы и эпителия трахеального матрикса. Наименьшее количество люминесцирующих участков обнаруживается по ходу трахейных стволов, в то время как клетки жирового тела и гиподермы полностью вовлекаются в инфекционный процесс.
В случае экспериментального воспроизведения ядерных полиэдрозов кишечного типа включения формируются в ядрах клеток эпителия среднего кишечника независимо от способа введения инфекционного материала. Однако при инъекциях полиэдров ложногусеницам соснового и тополевого волосатого пилильщиков антиген выявляется во всем монослое эпителиальных клеток. Пероральное заражение личинок приводит первоначально к поражению групп клеток, лежащих ближе к заднему отделу кишечника. Инфекционный процесс распространяется на все участки среднего отдела кишечника в течение 72—96 ч.
При ядерных полиэдрозах общего типа в развитии инфекционного процесса также наблюдаются некоторые особенности, зависящие от способа введения вируса в организм насекомого. Интралимфальное введение полиэдров способствует их активному фагоцитозу и постепенному разрушению в цитоплазме форменных элементов. Комплексные антигены телец-включений начинают выявляться синхронно в периферических зонах ядер клеток жирового тела и гемоцитов. Вслед за этим специфическое свечение появляется в клетках трахеального матрикса, гиподермы и некоторых других. При алиментарном заражении насекомых общая топография локализации включений не меняется, однако в гемолимфе развитие патологических изменений задерживается примерно на 24 ч. Последовательность тканевых поражений следующая: жировое тело, эпителий трахеального матрикса, гиподерма, гемоциты, поперечнополосатые мышцы, мальпигиевы сосуды и шелкоотделительные железы.
В ходе развития вирусных болезней происходят сложные биохимические изменения в клетках всех тканей насекомых, которые могут служить основой для разработки ранней диагностики патологических изменений. Наиболее характерны нарушения обмена нуклеиновых кислот, что связано с их особой ролью в органическом мире. Одним из самых характерных свойств нуклеиновых кислот является способность к сохранению и передаче биологической информации. При участии этих соединений образуются белковые молекулы, обусловливающие процессы обмена веществ. Помимо синтеза белка и передачи наследственных свойств, нуклеиновые кислоты играют особую роль в размножении вирусов, поэтому нуклеиновому обмену при вирозах насекомых уделяется большое внимание. В частности, установлено, что в процессе образования вирусных включений-полиэдров увеличивается содержание ДНК при одновременном уменьшении количества РНК. Суммарное содержание ДНК и РНК остается постоянным. С. М. Гершензон выделил инфекционную РНК из больных полиэдрозом гусениц тутового шелкопряда. Е. Ф. Уланова на гусеницах 1-говозраста тутового шелкопряда показала изменения нуклеиновых кислот, происходящие в ходе развития инфекции и связанные с образованием в ядрах клеток полиэдров. Известны более ранние работы по этому вопросу, выполненные рядом исследователей на личинках насекомых при ядерных полиэдрозах. Имеющиеся данные относятся преимущественно к тутовому шелкопряду, инфицированному вирусом ядерного полиэдроза общего типа.
Для выяснения динамики изменения нуклеиновых кислот у хвое — и листогрызущих насекомых нами применен метод люминесцентной микроскопии с акридиновым оранжевым. Этот краситель использован в связи с тем, что установлена способность акридинового оранжевого при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами придавать ДНК зеленую, а РНК красную флуоресценцию. Способ комплексообразования зависит от вторичной структуры нуклеиновых кислот. Двутяжевая нативная ДНК и спирализованные участки РНК связываются с отдельными молекулами акридинового оранжевого так, что образование димеров оказывается невозможным. Молекулы флуорохрома встраиваются между нуклеотидами нативной ДНК. Подобная связь наблюдается между тремя парами нуклеотидов. Расстояние между молекулами акридинового оранжевого при этом настолько велико, что образование димеров исключается и комплекс флуоресцирует зеленым.
Денатурированные ДНК и РНК представляют по своей структуре больше возможностей для присоединения акридинового оранжевого в условиях, аналогичных условиям в насыщенных растворах красителя. Это приводит к красной флуоресценции. Установленная метахромазия находит применение в патологии насекомых. Так, люминесцентномикроскопическое изучение нуклеиновых кислот при вирусных болезнях насекомых проведено у долгоножки, инфицированной вирусом полиэдроза и радужным вирусом.
Изменения в содержании нуклеиновых кислот при ядерном полиэдрозе гусениц тутового шелкопряда показаны Л. М. Тарасевич, Е. Ф. Улановой и некоторыми другими исследователями. Нами этот вопрос изучен на примере кишечного полиэдроза у пилильщиков (рыжего соснового и тополевого волосатого) и ядерного полиэдроза общего типа у туркестанской златогузки.
Поскольку некоторые экспериментальные воздействия влияют на характер люминесценции компонентов ядра, затрудняя интерпретацию получаемых результатов, мы с целью более точной идентификации ДНК обрабатывали контрольные препараты ДНК-азой, а также применяли гистохимические реакции Фельгена и Браше. Для идентификации РНК использовали РНК-азу.
Как уже отмечалось, вирус ядерного полиэдроза развивается у пилильщиков только в ядрах эпителиальных клеток среднего отдела кишечника. Эпителий здоровых ложногусениц обоих видов пилильщиков в основной своей части состоит из однотипных цилиндрических клеток с крупными продолговатыми ядрами. Единично встречаются бокаловидные клетки. На поперечных срезах личинок видно, что цилиндрические клетки эпителия имеют форму прямоугольника размером 118—135 мк. На пленчатых препаратах со стороны щеточной каемки эти клетки имеют форму шестиугольника со сглаженными углами. Отношение высоты клетки к поперечнику основания составляет примерно 3:1. Основания клеток примыкают к базальной мембране, а с апикальной стороны ограничены щеточной каемкой высотой примерно 20—30 мк. Ядра нормально функционирующих клеток кишечного эпителия размером 40—60 мк располагаются в центральной части цитоплазмы, несколько ближе к основанию клетки. Нативные ядра эпителиальных клеток в обычном световом микроскопе оптически гомогенны. С помощью метода фазовых контрастов обнаруживается оболочка ядра, а внутри — от одного до нескольких округлых, преломляющих свет ядрышек.
В ядрах нормально функционирующих клеток кишечного эпителия присутствуют гранулы, дающие положительную реакцию Фельгена и содержащие большое количество ДНК. Ядрышки родственны пиронину и содержат РНК. При окрашивании клеток кишечного эпителия акридиновым оранжевым ядро имеет зеленую люминесценцию из-за наличия ДНК, цитоплазма и ядрышки — красную или оранжево-красную из-за наличия РНК. Подтверждением этому является обработка препаратов соответствующими нуклеазами, снимающими свечение. Характер люминесцентномикроскопических картин существенно меняется в зависимости от концентрации флуорохрома.
Указанные особенности цветового свечения эпителия клетки среднего кишечника проявляются при концентрации акридинового оранжевого 50—100 мкг/мл, соответствующей разведению 1:50 000—1:100 000. С понижением содержания красителя в растворе внеядрышковый хроматин люминесцирует диффузнозеленым; ядрышки более ярких тонов; цитоплазма тускло-зеленая и содержит большое количество ярко-красных цитоплазматических гранул. При использовании режимов флуорохромирования внеядрышковая часть ядер приобретает диффузное зеленое свечение в виде сети. Интенсивно люминесцирующая зеленая сеть выявляется не только в ядрах эпителиальных клеток среднего кишечника, но и в гемоцитах и клетках жирового тела. Зеленое свечение является результатом адсорбции акридинового оранжевого на ядерной ДНК, что было впервые показано советскими исследователями на культурах клеток. В опытах дезоксирибонуклеиновая природа люминесцирующей ярко-зеленым ядерной сети подтверждалась гасящим эффектом ДНК-азы. В препаратах нормально функционирующих клеток кишечного эпителия подобная сеть выявлялась после их фиксации и окраски по Фельгену.
Из числа морфологических признаков, характерных для клеток, обработанных акридиновым оранжевым в норме, следует отметить наличие в цитоплазме большого количества ярко-красных гранул размером 0,5—3 мк, особенно в околоядерной зоне.
Через 24 ч после заражения личинок вирусами ядерного полиэдроза в чувствительных клетках насекомых происходят сложные изменения. Микроскопия препаратов, окрашенных по Фельгену и Браше, показывает нарушение нормальной структуры большей части ядер: ядрышки несколько разбухают, при этом их пиронияофильная реакция полностью сохраняется; хроматин аггрегируется в отдельные тяжи, и масса ядра увеличивается. В процессе развития инфекции аггрегирующийся хроматин ядра приобретает Фельген-отрицательную реакцию. Через 24 ч с момента заражения у ложногусениц тополевого (осинового) волосатого пилильщика в ядрах эпителия появляется периферическая кольцевая зона, которая не окрашивается обычными гистологическими красителями. В кольцевой зоне и в отдельных участках центральной части ядра начинается формирование полиэдренных телец. На первых этапах генезиса они представляют собой мельчайшие зерна, напоминающие гранулы, образующиеся при гранулезах насекомых, которые лежат на грани разрешения обычных световых микроскопов. С момента образования кольцевой зоны и формирования полноценных вирусных включений проходит примерно 35—40 ч.
Одновременно с появлением зачатков полиэдров преимущественно по периферии ядра в центральной его части формируется хроматиновая зона с находящимися здесь же ядрышками, которые в этот период частично разбухают, и их содержимое освобождается. В некоторых клетках ядрышки сохраняют морфологическую целостность до самых последних этапов инфекционного процесса, когда ядро полностью разрушается, переполняясь полиэдрами. Деструкцию ядрышек можно наблюдать и на электронно-микроскопических снимках с ультратонких срезов кишечного эпителия. На данном этапе развития инфекционного процесса в центральной части ядра хроматин образует различной формы и величины островки, в которых отмечено присутствие нуклеиновых кислот. При обработке срезов рибонуклеазой глыбки хроматина, окрашенные реактивом Шиффа в пурпурно-красный цвет, приобретают резко выраженную ячеистую структуру, что свидетельствует о наличии в хроматине помимо ДНК некоторого количества РНК. Различные цитохимические реакции постоянно обнаруживают в центральной хроматиновой массе присутствие ДНК.
По мере созревания полиэдров гипертрофия ядра нарастает. Центральная хроматиновая масса редуцируется и на срезах обнаруживаются лишь небольшие островки хроматина. Развитие вируса завершается разрывом ядерной оболочки и выходом созревающих включений в цитоплазму. У осинового волосатого пилильщика, тельца-включения по выходе из ядра попадают, как правило, в апикальную часть клетки и затем в основной своей массе в просвет кишечника. Полиэдры обнаруживаются в цитоплазматических каплях секрета и в тех случаях, когда микроскопически не выявляется нарушение ядерной оболочки. Можно предполагать, что какое-то количество включений проникает через ядерную оболочку и с секретом выводится за пределы клетки.
Люминесцентная микроскопия эпителия среднего кишечника показывает что здоровые нативные клетки в видимой части спектра практически не обладают свечением. На срезах ложногусениц тополевого и рыжего соснового пилильщиков, обработанных раствором акридинового оранжевого на фосфатном буфере с рН-5,91 в соотношении 1 :50 000, через 24—30 ч после заражения клетки вирусом в структуре ядра происходят изменения. Зона зеленой люминесценции, характерная для нормально функционирующего ядра, сокращается в 2 раза и более и отходит от ядерной мембраны. Параллельно с этим появляются тускло люминесцирующие и совершенно темные зоны.
Участки, люминесцирующие зеленым, через 48 ч после попадания включений в пищеварительный тракт обособляются, формируя центральную хроматиновую массу. Центральная хроматиновая масса люминесцирует зеленым, причем на различных этапах инфекционного процесса цвет остается без изменений, меняется лишь его интенсивность. Наиболее яркая люминесценция наблюдается в центральной части в период формирования обширной зоны, не обнаруживающей признаков какого-либо свечения. Зеленая зона, соответствующая образованию, за которым в литературе укрепилось название «центральной хроматиновой массы», не всегда расположена центрально. Нередко она представлена группой овальных образований, которые могут находиться в любой точке ядра, или может быть вытянутой и многолопастной. Через 96 ч после заражения область зеленой зоны редуцируется и может совершенно исчезнуть, однако во многих ядрах интенсивно люминесцирующие островки остаются до полного распада ядер.
В обширных зонах, где отсутствует люминесценция, формируются вирусные включения. В острый период болезни, наступающий у ложногусениц пилильщиков через 96—120 ч после заражения, завершается образование полиэдров, ядерная мембрана лопается и клетка гибнет. В этот период в препаратах можно обнаружить отдельные ядра эпителиальных клеток среднего кишечника, в которых помимо центральной ДНК-содержащей хроматиновой массы, обнаруживается большое количество зерен 0,5—1,5 мк, люминесцирующих оранжево-красным. Обработка РНК-азой в значительной мере снимает оранжево-красную люминесценцию, что позволяет предполагать их рибонуклеиновую природу. Возможно, что ядро, находящееся в патологическом состоянии, в некоторых случаях интенсивно продуцирует ядерную РНК, транспорт которой в цитоплазму нарушается под действием вирусной инфекции.
Принятые режимы флуорохромирования препаратов акридиновым оранжевым в острый период развития инфекционного процесса интенсивно окрашивают цитоплазму и остатки хроматина, и все структуры люминесцируют оранжево-красным, что свидетельствует о резком увеличении проницаемости клеточной оболочки и ядерной мембраны; не люминесцирует лишь периферическая зона ядра. Вирус развивается не во всех клетках. Отдельные группы цилиндрических клеток остаются интактными у ложногусениц рыжего соснового пилильщика до самых последних этапов инфекционного процесса. Однако в острый период болезни и в период, предшествующий гибели насекомого, такие клетки начинают интенсивно воспринимать акридиновый оранжевый и люминесцируют диффузно яркими красными точками.
При экспериментальном воспроизведении ядерного полиэдроза общего типа туркестанской златогузки динамика клеточных изменений аналогична описанной для ложногусениц пилильщиков при кишечных полиэдрозах, но патологические процессы развиваются с меньшей скоростью. Тушение люминесценции в периферических участках ядра инфицированных вирусом клеток происходит после 48 ч с момента заражения, начало формирования вирусных включений в ядре — через 96—120 ч.
Гистохимические реакции Фельгена, Браше и метод люминесцентной микроскопии с применением акридинового оранжевого позволили проследить характер изменения состава нуклеиновых кислот в клетках насекомых при различных типах заболеваний.
У ложногусениц рыжего соснового и тополевого (осинового) волосатого пилильщиков при заражении ядерным полиэдрозом кишечного типа в первый период развития инфекционного процесса (примерно 24—30 ч) наблюдаются формирование ДНК- содержащей центральной зоны и тушение люминесценции в периферических участках. В подострый период болезни (от 30 до 72 ч) содержание РНК в ядре увеличивается, и в нелюминесцирующей зоне появляются зачатки вирусных включений; острый период характеризуется завершением формирования полиэдров, резким повышением сродства клеточного материала акридиновому оранжевому и разрушением клеток. Формирование центральной хроматиновой массы, люминесцирующей зеленым, отмечено также у гусениц тутового шелкопряда при ядерном полиэдрозе общего типа. Следует отметить, что общая масса хроматина в ходе всего инфекционного процесса не меняет цвета люминесценции, что свидетельствует о стабильности ее качественного содержания.
В начальный период инфекционного процесса наблюдается только временное тушение люминесценции, что, видимо, соответствует перестройке в метаболизме клетки, направленной на синтез свойственной вирусу дезоксирибонуклеиновой кислоты и веществ, образующих белковый матрикс полиэдров. В целом же исследования показывают, что в клетках насекомых, пораженных различными вирусами, происходят если не идентичные, то весьма близкие процессы, связанные со стимуляцией геномом вируса синтеза ненужной для клетки чужеродной ДНК и ряда других компонентов, что приводит в случае продуктивного взаимодействия системы вирус-клетка к гибели клетки, а в случае инклюзионных энтомопатогенных вирусов и к гибели насекомых-хозяев.