Приготовление простых микроскопических препаратов. На чистое предметное стекло, для обезжиривания протертое 40%-ным спиртом, наносят пипеткой 1 — 2 капли воды.
Излишек воды вреден, так как препарат начинает «плавать», а недостаток ее ведет к сокращению объема капли под покровным стеклом, что затрудняет наблюдение. Небольшое количество мицелиального налета или споровой массы отделяют ланцетной иглой, переносят в каплю воды и измельчают второй иглой. Если налет гриба не удается отделить от растения, маленький (несколько миллиметров) кусочек пораженной грибом ткани снимают острым скальпелем, переносят в каплю воды, измельчают двумя иглами и накрывают чистым покровным стеклом. Чтобы избежать образования воздушных пузырьков, мешающих наблюдению, покровное стекло ставят на левый край и затем осторожно укладывают вправо. В большинстве случаев размеры исследуемых объектов настолько велики, что при использовании бинокулярного микроскопа сначала работают с окулярами 7Х или 10X и объективами, 20X или 40X и только при более детальном исследовании переходят на сильное увеличение.
Выдерживание растительного материала во влажной камере. Влажной камерой может служить любой закрытый сосуд с почти 100%-ной относительной влажностью. Для этого наиболее пригодны чашки Петри соответствующего исследуемому материалу размера, преимущественно 90—150 мм. Для обеспечения высокой влажности воздуха дно и крышку чашки выстилают влажной фильтровальной бумагой. Чтобы степень загрязнения была минимальной, лучше всего использовать дистиллированную воду. На дне чашки вода не должна собираться, так как она может вызвать загнивание материала. Поэтому диски фильтровальной бумаги рекомендуется закладывать в чашки после увлажнения и стекания избытка воды, а не заливать их в чашке (переувлажнение) или сбрызгивать (слишком быстрое высыхание).
Предназначенные для закладки части растений тщательно моют под проточной водой. Клубни, стебли и аналогичные части растений, предположительно содержащие возбудителя в тканях, поверхностно дезинфицируют путем погружения на 1—2 мин в 70%-ный спирт, 0,1%-ную сулему или раствор гипохлорита натрия (торговый препарат или разведенный дистиллированной водой как 1:3). Поверностную дезинфекцию можно провести также путем выдерживания материала в растворе хлорамина (10 г/л, 2,5 г активного хлора) в течение 10 мин. Затем материал режут обожженным в спирте скальпелем с таким расчетом, чтобы разросшийся на срезе возбудитель через несколько часов или дней можно было использовать для приготовления препарата.
Влажные камеры выдерживают при 15—20 °С. Если речь идет о возбудителе, предпочитающем более низкие температуры, лучше выдерживать камеры при 8—10 °С, чтобы сдержать зарастание материала гнилостными и плесневыми грибами. Продолжительность инкубации материала во влажной камере определяется временем, необходимым для развития плодовых тел и спор соответствующего вида гриба. Как правило, она составляет 1—3 дня, но может достигать и двух недель. При необходимости фильтровальную бумагу в чашках дополнительно увлажняют каплями дистиллированной воды. При контроле за состоянием материала необходимо иметь в виду, что во влажных камерах условия благоприятны не только для возбудителя, но и для всех микроорганизмов, находящихся на растении, например для видов Fusarium, Alternaria, Penicillium и др. Особенно важно предупредить об этом малоопытных сотрудников, которые могут сделать ошибочные заключения.
Приготовление срезов вручную. Органы и мицелий гриба, находящиеся в растительных тканях, можно обнаружить в окрашенных тонких срезах, а иногда и без дополнительного окрашивания. Чтобы получить особо тонкий срез, требуются специальные аппараты, например микротомы различных типов. Для нужд практической защиты растений, в частности при обнаружении Synchytrium endobioticum — возбудителя рака картофеля, достаточно простых срезов, сделанных с помощью острой бритвы. Мягкие и нежные части растений, в том числе тонкие листья, для приготовления срезов вручную вкладывают в опорный материал, например в сердцевину бузины.
Обнаружение возбудителя рака картофеля. Кусочек нароста зажимают между большим и указательным пальцами левой руки и лезвием бритвы срезают часть нароста для получения ровной поверхности. Затем делают несколько очень тонких срезов, захватывая при этом краевые клетки, и помещают их в каплю воды на предметное стекло. В тонких срезах при поражении картофеля S. endobioticum видны зимние спорангии гриба.
Обнаружение мицелия в листьях. Достаточно толстый кусочек сердцевины бузины надрезают сверху на глубину около 1 см, в разрез вставляют часть листа, предположительно содержащую мицелий, сжимают обе половинки сердцевины и делают несколько тонких срезов бритвой. Срезы переносят в каплю воды на предметном стекле, сердцевину осторожно удаляют препаровальной иглой. Если необходимо, срезы можно окрасить и затем просмотреть под микроскопом.
Метод оттисков. Предметное стекло покрывают слоем прозрачного клея, размягченного парами спирта. Пораженный лист прижимают к слою клея, затем удаляют. Споры в слое можно окрасить парами йода.
Оттиски с поверхности листьев получают также с помощью целлоидина, который размягчают, добавляя 30—40% касторового масла. С помощью стеклянного шпателя целлоидин наносят тонким слоем на поверхность листа, затвердевшую пленку осторожна снимают пинцетом, помещают в воду или 96%-ный спирт и просматривают под микроскопом. В спирте целлоидиновая пленка набухает, мешающая наблюдению поверхностная структура исчезает, и гриб сохраняется в естественном состоянии.
Для получения оттисков можно использовать также желатин. 20 г сухого желатина растворяют при нагревании в 100 мл воды и наносят тонким слоем на исследуемую часть растения. При застывании (через 60—90 мин) слой слегка сморщивается, что приводит к образованию воздушных пузырьков. Оттиск осторожно снимают, на короткое время погружают в спирт для удаления воздушных пузырьков и переносят в воду на предметном стекле. Особое преимущество этой методики состоит в том, что мицелий достигает полного тургора и поперечные перегородки в гифах и спорах видны очень четко.
Еще один пригодный субстрат — клейкая лента, куски которой накладывают на поверхность листа и плотно прижимают, чтобы не появились пузырьки воздуха, затем сразу снимают и используют для приготовления водных препаратов. Если препараты окрасить хлопковой синью, приставшие к клейкой ленте споры и мицелий становятся более заметными.
Метод оттисков позволяет обнаружить только те структуры гриба, которые находятся на поверхности листьев. Чтобы выявить проникшие в клетки эпидермиса гифы, гаустории и др., нужны препараты срывов эпидермиса или осветление исследуемого растительного материала.
Срывы эпидермиса. Для приготовления срывов эпидермиса лист зажимают пальцами левой руки таким образом, чтобы он плотно прилегал к указательному пальцу. Эпидермис надрезают бритвой, от линии надреза пинцетом срывают кусочек и помещают в каплю воды. Окрашивание препарата хлопковой синью и в этом случае улучшает видимость спор и мицелия.