В 1931 г. Маст, изучая действие голодания на продолжительность жизни амебы, установил, что отдельные экземпляры амеб способны жить без пищи в течение 16 дней при концентрации солей в культуральной среде ниже оптимальной и в течение 18—22 дней — в сбалансированной среде. Анализируя проблему старения и смерти простейших и беспозвоночных, Дженнингс приводит достаточно убедительную картину их старения.
Вслед за первыми исследованиями Мопа появились более подробные работы Калкинса, который изучал инфузорию Uroleptus mobilis Engelm и другие виды простейших. Он четко показал, что для поддержания жизни штамма Uroleptus необходимы периодические конъюгации и что функциональная активность штамма отчетливо зависит от времени, прошедшего с момента конъюгации. Применительно к Paramecium bursaria и другим ресничным инфузориям Дженнингс формулирует следующие положения: 1) некоторые клоны, например, Eudorina, могут считаться бессмертными; 2) хотя конъюгация (или ее эквивалент — эндомиксис) приводит к омоложению линии, наряду с большим числом короткоживущих клонов возникает некоторое количество долгоживущих; 3) функция омоложения не связана с генетическим расщеплением.
Некоторую путаницу в эти представления о парамециях внесла работа Вудреффа, который содержал отдельные изолированные линии Paramecium без полового процесса на протяжении более чем 13 000 поколений. Хотя при этом конъюгации не наблюдалось, ему удалось подметить «новое явление», которое он назвал «эндомнксисом» (аутогамия). Дискуссия по этому вопросу проделала полный круг, когда в 1957 г. Сониеборн и Рофолко сообщили, что «вариант 15 Paramecium multimicronucleatum отличается как от Paramecium aurelia, так и от других видов Paramecium тем, что он не способен к аутогамии. При длительном наблюдении над размножением изолированных линий этого варианта не было обнаружено никаких признаков старения».
В 1929 г. Бирс также сообщил, что ресничная инфузория Didinium размножалась на протяжении 1384 поколений без конъюгации или эндомиксиса, не теряя при этом своей функциональной активности, которую оценивали по среднему числу поколений в день.
Исследования Остина над Uroleptus mobilis показали, что голодание увеличивает продолжительность жизненного цикла этого простейшего, которому свойственно клональное старение, на 50 дней. Это соответствует увеличению средней продолжительности жизни всего на 10%. В норме линии этого вида живут около 1,5 лет, а затем вымирают. Для некоторых выведенных путем отбора линий Paramecium aurelia Сопиеборпу не удалось доказать существования эндомиксиса. Эти линии в отличие от Paramecium multimicronucleatum в конечном итоге вымирали.
Все описанные исследования на простейших свидетельствуют о том, что для поддержания жизнеспособности линии одних видов необходима конъюгация, или ее эквивалент — аутогамия, тогда как другие могут существовать и без этих процессов. По-видимому, связь между половым процессом и жизнеспособностью не универсальна. Совсем недавно Соннеборн высказал предположение, что старение клонов свойственно тем видам, для которых характерна скученность, и вероятность встречи с потенциальным конъюгантом велика, тогда как у видов с рассеянным распространением, которым подолгу приходится ждать конъюгации, выработались механизмы для преодоления старения клонов.
Резюмируя сказанное выше, приведем некоторые замечания Соннеборна, высказанные на недавно происходившем симпозиуме.
«Различные виды Paramecium чрезвычайно отличаются друг от друга по продолжительности жизни клонов. Один вид может жить 2 месяца при условии избытка пищи и в отсутствие других организмов, другой живет 18 месяцев, третий существует годами. Виды с малой продолжительностью жизни представляют собой продукты инбридинга, дающие плодовитое жизнеспособное потомство даже после самооплодотворения. Виды, отличающиеся большой продолжительностью жизни, в норме неспособны к близкородственному скрещиванию; естественный отбор сохранил такие комбинации генов, которые обеспечивают длительную жизнь клонов, благодаря чему у них достаточно времени для встречи с соответствующими партнерами. Некоторые исследователи наблюдали за культурами клонов Tetrahymena pyriformis в течение нескольких десятилетий. Эти культуры утрачивали свои микронуклеусы и становились в генетическом смысле мертвыми».
Касаясь характера возрастных изменений у Paramecium, Соннеборн и Дипель сообщают, что «наиболее ранними видимыми проявлениями старения у Paramecium aurelia (вариант 4) являются отклонения от нормального числа ядер. Через 40—50 дней с момента возникновения клона при оплодотворении начинают появляться особи, число ядер у которых колеблется от 1 до 4 вместо нормальных 2; кроме того, наблюдаются отклонения в ориентировке веретена в процессе деления. Еще через 10 дней в фигурах деления микронуклеусов появляются признаки склеивания хромосом в метафазе и мостики — в анафазе. Встречаются и другие аномалии митоза. Макронуклеусы и ротовой аппарат оказываются у конца тела, а не посередине, по-видимому, потому, что средняя часть тела во время деления не растет. Другой признак нарушения роста состоит в том, что деление не завершается и две дочерние клетки оказываются связанными в цепочку. В более старых клонах (насчитывающих 80 дней) только что описанные аномалии выражены более резко и встречаются чаще. Эти аномалии возникают, как правило, в результате нарушения временных соотношений в удвоении и расхождении делящихся компонентов, в частности ядер и ротового аппарата. Микронуклеусы и ротовой аппарат начинают делиться лишь после появления плоскости деления и после разделения макронуклеуса. Последний фактически делится преждевременно. Такая асинхронность деления приводит к образованию безъядерных особей и особей, лишенных глотки. Итак, самым существенным и явным признаком старения парамеции является разрушение существующей в норме корреляции во времени деления и дупликации компонентов клетки».
В другой работе Соннеборн и Шнеллер подчеркивают значение «индекса потомства, а именно доли нормальных жизнеспособных особей, как показателя старения в потомстве, возникшем в результате аутогамии. Эта доля постепенно падает от 100% до 0. Сущность описанного явления состоит в постепенном разрушении цитоплазмы по мере старения клона. Процессы, связанные с половым размножением, особенно чувствительны к влиянию возраста цитоплазмы. Увеличивается процент особей, погибающих во время конъюгации и по ее завершении; случаи гибели обнаруживаются тогда, когда начинает функционировать новый генетический аппарат, т. е. после нескольких делений. Наконец, поражаются и вегетативные ядра. Если в безъядерные старые экземпляры парамеций ввести путем скрещивания нормальные ядра, взятые от молодых особей, то они через несколько дней повреждаются.
Опыты по скрещиванию клеток молодых клонов со старыми показывают, что ядра из старых клонов несут какие-то доминантные летали. Однако если клон не слишком стар, то первое поколение оказывается нормальным или почти нормальным. Второе поколение, полученное от еще молодых особей первого поколения, совершенно нежизнеспособно. Следовательно, гибриды старых клонов с молодыми несут рецессивные хромосомные летали. Степень повреждения пропорциональна возрасту старого родителя. Большинство обнаруженных повреждений носит характер хромосомных аббераций, но встречаются и генные мутации.
В 1938 г. Джильбер тщательно исследовал влияние продолжительности периода между эндомиксисами на смертность Paramecium aurelia. Предвосхитив данные Соннеборна, он показал, что чем меньше промежуток между двумя следующими друг за другом эндомиксисами, тем ниже смертность потомства. Если период между эндомиксисами продолжался 10 дней, то погибало лишь 5,9% потомства, если этот период составлял 18 дней, погибало 21,3%, а если он достигал 28 дней, то смертность повышалась до 41,8%.
Во всяком случае, из исследований процессов клонального старения простейших мало что можно извлечь для понимания старения Metazoa. По всей видимости, наибольшее сходство со старением многоклеточных проявляется у сосущей инфузории Tokophrya infusionum, которую подробно изучила Рудзинская. У Tokophrya, размножающейся при помощи почкования, имеется четко выраженная разница между родительской и дочерней особями, как правило, отсутствующая у других форм простейших.
Tokophrya протыкает стенки клеток других простейших, служащих ей добычей, многочисленными копьеобразными трубочками, выступающими над поверхностью ее тела. После этого содержимое тела жертвы (например, Tetrahymena) перекачивается в тело хищника. Tokophrya размножается весьма своеобразно: молодые особи образуются в верхней части старой. После их освобождения они уплывают и где-нибудь прикрепляются. Эти животные чрезвычайно прожорливы, и количество потребляемой ими пищи влияет на продолжительность их жизни. При обильной пище они живут в среднем несколько дней; если периоды обильного питания перемежаются с периодами голодания, продолжительность жизни составляет в среднем около 10 дней; если же животные находятся на скудном рационе, а временами вовсе голодают, то продолжительность их жизни достигает в среднем 14—17, а у отдельных особей — 21—22 дней. В отличие от ресничных инфузорий, у которых старение клонов, по-видимому, является результатом генетически контролируемых изменений, проявляющихся в повреждении цитоплазмы, у Tokophrya дегенерация цитоплазмы выражена значительно сильнее и связана с накоплением пигмента или продуктов жизнедеятельности. Эти изменения отчетливо видны на электронных микрофотографиях.