Нет нужды подробно останавливаться на обзоре всей литературы по вопросам радиочувствительности гидробионтов к внешнему облучению, т. к. он в достаточно полной и обстоятельной форме сделан Г. Г. Поликарповым (1964).
Из этого обзора следует, что радиочувствительность водных организмов к внешнему однократному облучению увеличивается от низших форм к более высокоорганизованным и уменьшается от ранних стадий их развития к более поздним. Например, дозы ЛД50 для бактерий составляют около 1 млн. р, для водорослей и некоторых простейших они колеблются от 4500 до. 120000 р, для ракообразных — от 1000 до 50000 р, а для взрослых особей рыб и отдельных представителей земноводных — от 700 до 3000 р. Полулегальная доза для радужной форели (Salmo gairdnerii) на стадии одной клетки после оплодотворения составляет 58 р, тогда как для взрослых особей она возрастает до 1500 р.
Особенно резкие изменения радиочувствительности рыб отмечаются в ходе оплодотворения и раннего дробления зиготы. В опытах с икрой вьюна (Misgurnus fossilis L.) и севрюги (Acipenser stellatus Pall.) установлено, что первый пик радиочувствительности соответствует стадии сближения мужского и женского пронуклеусов, а последующие — предшествуют интеркинетическому состоянию ядра между делениями дробления. Нами аналогичные данные были получены в опытах с икрой щуки. В этих опытах икру щуки сразу после осеменения разделяли на несколько порций по 150—200 икринок и помещали в чашки Коха с озерной водой. Через 20 минут после осеменения первую порцию икры облучали гамма-лучами кобальта-60 в дозе 200 р при мощности дозы 26 р/мин. Каждую последующую порцию икры облучали в той же дозе через 10 минут после начала облучения предыдущей с учетом того, что восемь минут уходило на процесс облучения и две минуты на установление чашки с очередной порцией икры над излучателем. В конечном итоге в опыте находилось три чашки с контрольной икрой, которую не подвергали облучению, и 20 чашек с икрой облученной в дозе 200 р на разных стадиях развития с момента осеменения. Развитие икры проходило при температуре воды 15°. В процессе проведения опыта 2-3 раза в день сменяли воду в чашках и отбирали погибших зародышей.
В качестве критерия радиочувствительности учитывали выживаемость эмбрионов, их среднюю продолжительность жизни до момента выклева и число личинок с различными морфологическими аномалиями (искривление Позвоночника, недоразвитость хвостового плавника, нарушение в строении сердца и кровеносных сосудов).
Облучение икры во всех случаях заметно снижает по сравнению с контролем процент выклева личинок и увеличивает выход личинок с морфологическими аномалиями. Средняя продолжительность «жизни эмбрионов до момента выклева их из икры, как правило, снижается, при этом коэффициент вариации средней продолжительности жизни возрастает. Последнее обстоятельство свидетельствует о том, что процесс гибели эмбрионов, развивавшихся из облученной икры, был относительно более растянут во времени, чем в контроле. Можно также заметить, что радиочувствительность икры в ходе развития после осеменения очень резко меняется. Первый пик радиочувствительности отмечен задолго до начала дробления зиготы, между 30 и 50 минутами после осеменения: облучение икры на этой стадии развития приводит к гибели всех эмбрионов в течение трех суток. Второй пик наблюдается перед появлением первой борозды дробления, между 120 и 140 минутами после осеменения, и третий пик проявляется на стадии 4—8 бластомеров.
Отмеченный характер изменения радиочувствительности в ходе оплодотворения и раннего дробления икры щуки как по времени, так и по внешнему проявлению хорошо соответствует данным, описанным ранее другими исследователями при облучении икры вьюна и севрюги. Как уже упоминалось, в этих работах было показано, что первый период повышенной радиочувствительности соответствует стадии сближения мужского и женского пронуклеусов, а последующие — связаны с разными фазами митотических циклов первых эмбриональных митозов. Можно полагать, что и в наших опытах с икрой щуки периоды повышенной радиочувствительности приурочены к этим же стадиям развития. Отсутствие явно выраженного пика радиочувствительности перед стадией четырех бластомеров в наших опытах объясняется вероятно тем, что наиболее чувствительный переходный период от стадии двух бластомеров к стадии четырех бластомеров совпал с моментом облучения икры, когда суммарная доза из-за малой мощности источника излучения еще не достигла необходимой величины.
Изменение радиочувствительности эмбрионов в течение всего периода эмбриогенеза прослежено нами на развивающейся икре линя (Tinea tinea L.) и яйцах пресноводного моллюска (Lymnaea stagnalis L.).
В опытах с линем оплодотворенную в лабораторных условиях икру, облучали на разных стадиях развития гамма-лучами кобальта-60 в дозе 250 р (при мощности дозы 24,5 р/мин) и инкубировали параллельно с необлученным контролем в чашках Коха с чистой озерной водой при температуре 20—23° до выклева личинок. В процессе инкубирования учитывали гибель икры, время выклева личинок, их количество, а также число личинок с морфологическими аномалиями. Через 24 часа после выклева одну часть личинок (по 100 шт. из каждого варианта опыта) подвергли дополнительному облучению в дозе 1500 р и учитывали их выживаемость в течение последующих 18—20 дней. Другую часть личинок оставляли на такой же срок без дополнительного облучения в качестве контроля.
При облучении икры до начала первого деления зиготы (через 15 мин. после осеменения) все эмбрионы несут те или иные признаки лучевого поражения. На более поздних стадиях развития радиочувствительность эмбрионов снижается, однако на стадиях четырех бластомеров, 16 бластомеров и средней бластулы она снова заметно возрастает. Эти пики радиочувствительности, по-видимому, обусловлены описанными выше изменениями радиочувствительности в ходе первых эмбриональных митозов. В последнее время их связывают с явлениями трансиндукции ДНК, т. е. с процессами изменения качества и объема генетической информации, необходимой для прохождения каждого следующего этапа развития эмбриона.
Массовый выклев личинок происходит между 52 и 56 час. после осеменения икры. При облучении икры до начала первого деления зиготы процесс выклева личинок значительно растягивается и заканчивается лишь через 72 час. с момента осеменения. Массовый выклев личинок в этом случае отмечается между 56 и 72 час. При облучении икры на более поздних стадиях развития процесс выклева личинок также, как в контроле, завершается в течение 8 час., между 48 и 56 час. после осеменения. Однако основная масса личинок здесь выклевывается, примерно, на 4 час, а при облучении на стадиях 32 бластомеров и средней бластулы — на 8 час. раньше чем в контроле. Следовательно, кроме отмеченных нами выше эффектов поражения эмбрионов, облучение икры линя в дозе 250 р на всех стадиях развития (за исключением наиболее радиочувствительной стадии, предшествующей первому делению зиготы) вызывает заметное ускорение выклева личинок.
Данные средней продолжительности жизни личинок, выклюнувшихся из икры, облученной на разных стадиях развития, показывают, что наиболее быстро погибают личинки, выклюнувшиеся из икры, облученной до начала первого деления зиготы. Продолжительность жизни личинок из икры, облученной на более поздних стадиях развития, как и следовало ожидать, оказалась значительно выше. Для стадий от первого деления зиготы (два бластомера) до средней бластулы продолжительность жизни личинок составляет, примерно, от 8 до 12, а для более поздних стадий — от 14 до 17 суток, при средней продолжительности жизни контрольных личинок — около 15 суток.
Дополнительное облучение личинок через 24 час. после выклева в дозе 1500 р резка снижает продолжительность жизни как в контроле, так и особенно в предварительно облученных вариантах опыта. Исключение составляют два последних варианта, которые соответствуют предварительному облучению эмбрионов перед самым выклевом и тотчас после выклева. В этих случаях средняя продолжительность жизни личинок оказалась несколько более высокой, чем даже в контроле, т. е. у личинок, выклюнувшихся из необлученной икры. Далее будет показано, что отмеченный феномен связан с радиозащитным действием предварительного облучения.
Следует заметить, что гибель личинок, выклюнувшихся из облученной икры, во всех случаях была более растянута во времени, чем в контроле. На это указывают высокие по сравнению с контролем коэффициенты вариации средней продолжительности жизни в облученных вариантах опыта. После дополнительного облучения в дозе 1500 р коэффициенты вариации резко снижаются, но для личинок, получивших дозу предварительного облучения на ранних стадиях развития икры, в целом, они были выше, чем в других вариантах.
В опытах с большим прудовиком кладки моллюска с яйцами на разных стадиях развития облучали гамма-лучами кобальта-60 в дозе 300 р при мощности дозы 36 р/мин. После этого их инкубировали параллельно с необлученным контролем в чашках Коха с озерной водой при температуре 18—20°. Наблюдения за развитием эмбрионов проводили под бинокулярной лупой МБС-1; учитывали гибель эмбрионов в разных вариантах опыта, число эмбрионов с разлитыми морфологическими аномалиями и число вылупившихся нормальных особей. Для определения наличия или отсутствия раковины все уродливые эмбрионы просматривали под микроскопом МБИ-6 в поляризованном свете при скрещенных поляроидах. Опыты проведены в шести повторностях, в каждом варианте использовано от 160 до 1600 яиц.
На общем фоне снижения радиочувствительности эмбрионов от ранних стадий развития к более поздним, так же как в опытах с икрой линя, выделяется несколько периодов повышенной радиочувствительности. Первый пик радиочувствительности и в этом случае соответствует стадии, предшествующей первому делению зиготы; второй пик соответствует переходному периоду от 4 к 8 бластомерам, а третий, менее значительный, отмечается в конце дробления.
Все многочисленные лучевые уродства эмбрионов, наблюдавшиеся в наших опытах, можно было разделить по морфологическим признакам на следующие три основных типа:
1. Эмбрионы с комплексным нарушением развития, у которых сильно недоразвиты производные как наружного (раковина, мантия), так и внутреннего зародышевых листков (отсутствие питательного мешка, уменьшение в нем желтка и другие изменения внутренних органов).
Этот тип уродств формируется главным образом при облучении ранних стадий развития, хотя встречается и при облучении поздних стадий, за исключением стадии велигер.
2. Эмбрионы, у которых недоразвиты производные внутреннего зародышевого листка, производные же наружного листка не имеют внешне заметных повреждений. Этот тип уродств также встречается при облучении эмбрионов на разных стадиях развития, но преимущественно присущ эмбрионам, развивающимся из яиц, облученных на стадии велигер. На этой стадии производные эктодермы (раковина, мантия) практически уже сформировались и, следовательно, не могли быть существенно поражены.
3. Эмбрионы, у которых недоразвиты производные наружного зародышевого листка и достаточно хорошо развиты производные внутренней закладки. Такой тип уродств отмечался лишь при облучении эмбрионов на переходной стадии от 4 к 8 бластомерам, когда проявляется второй пик повышения радиочувствительности.
Все три типа лучевых уродств отличались от контрольных эмбрионов также меньшими размерами и уменьшением пигментации тела.
В зависимости от стадии облучения изменяется не только общий выход уродливых эмбрионов, но и характер этих уродств. Так, при облучении яиц на стадии, предшествующей дроблению, отмечается относительно высокий выход общего числа уродов, при этом 78% из них характеризуются полным отсутствием раковины, в 22% отсутствием питательного мешка. Следовательно, на этой стадии относительно более радиочувствительны те системы, которые ответственны за формирование эктодермальной закладки развивающегося зародыша.
При облучении на стадии 2-х бластомеров отмечено снижение общего выхода уродливых эмбрионов и увеличение числа уродов с аномалиями в развитии питательного мешка. Можно полагать, что наблюдаемое на этой стадии снижение общей радиочувствительности эмбрионов сопровождается относительным повышением радиочувствительности тех систем развивающегося зародыша, которые впоследствии приводят к формированию энтодермальной закладки.
Облучение эмбрионов на переходной стадии от 2 к 4 бластомерам вызывает примерно одинаковый процент уродств с аномалиями в развитии внешних и внутренних органов, а при облучении на последующих стадиях дробления опять увеличивается относительное число эмбрионов с аномалиями в развитии внутренних органов.
На стадии начала гаструляции и более поздних стадиях радиочувствительность эмбрионов снова снижается, что выражается в резком уменьшении общего выхода уродов. При этом подавляющее большинство уродств проявляется здесь в виде нарушений производных внутренней, энтодермальной закладки, а при облучении на стадии велигер этот тип уродств достигает 100%. Такое сильное снижение числа аномалий в формировании раковины моллюсков при облучении на поздних стадиях развития объясняется, вероятно, более быстрой специализацией клеток эктодермы по сравнению с клетками энтодермальной закладки. Клетки же, закончившие специализацию, оказываются значительно более радиорезистентными. Действительно, на стадиях трохофоры и велигера производные эктодермы функционируют как вполне сформировавшиеся наружные покровы, тогда как процессы специализации производных энтодермы на этих стадиях далеко еще не закончены.
Наконец, следует отметить, что все уродливые эмбрионы моллюска оказались неспособными выйти из яйцевых капсул и рано или поздно погибали. После выхода из кладки нормальных молодых особей в окружающую среду целостность коконов нарушалась, и оставшиеся как правило быстро поражались грибком.
В опытах с икрой щуки изучали зависимость радиочувствительности эмбрионов от температуры воды. Икру получали от половозрелых самок во время нереста на оз. М. Миассово. Оплодотворение проводили сухим способом, смешивая икру от одной самки с семенной жидкостью от двух или трех самцов. Сразу после оплодотворения (до начала первого дробления зиготы) икру подвергали лучевому воздействию гамма-лучами кобальта-60 и затем инкубировали ее в озерной воде при температуре воды 10 и 20°. Помимо общего выклева учитывали число личинок с морфологическими аномалиями и число клеток с хромосомными аберрациями.
Для цитологического анализа икру фиксировали на стадии поздней бластулы смесью Карнуа: шесть частей спирта, три части уксусной кислоты и одна часть хлороформа. Через 15 минут после помещения в фиксирующий раствор оболочки икринок прокалывали и производили смену фиксатора; через три часа после начала фиксации икру помещали в 70%-ный этиловый спирт для хранения.
Количественный учет хромосомных аберраций проводили на давленных препаратах, окрашенных ацетолакмоидом. Перед окраской отпрепарированные зародышевые диски помещали для мацерации на 10 мин. в 30% раствор молочной кислоты. Из окрашенных таким образом зародышевых дисков готовили временные давленные препараты, которые удобны тем, что в них все клетки зародышевой ткани расположены в один слой и не содержат артефактов в виде фрагментов, возникающих при резке микротомным ножом. На каждом препарате просчитывали по 50 анафаз и определяли процент поврежденных клеток. Клетка считалась поврежденной, если она содержала хотя бы один мост или фрагмент. Выклев личинок заметно снижается по сравнению с контролем при облучении в дозах свыше 100 р. Примерно в этом же диапазоне доз отмечается повышение числа уродливых форм. Доза 800 р оказалась абсолютно летальной, эмбрионы при этой дозе облучения погибли на стадии ранней гаструлы. В опыте при температуре воды 20° снижение общего выклева личинок наблюдается при дозе 200 р, а повышение выхода уродливых форм происходит, начиная с доз облучения 50—100 р. В этих условиях, в отличие от опыта с более низкой температурой, абсолютно летальной оказалась доза 400 р. При температуре воды 10° число уродливых форм возрастает при относительно высоких дозах облучения, тогда как при температуре 20° число уродов увеличивается, начиная с дозы 50 р.
Поскольку при 20° эмбриональное развитие щуки проходило вдвое быстрее, чем при 10° можно полагать, что наблюдаемое снижение радиочувствительности эмбрионов при меньшей температуре связано с восстановительными процессами, реализация которых при более растянутом во времени развитии эмбрионов несколько возрастает.
Следует отметить, что по числу поврежденных митозов различия между контролем и опытом заметны уже при дозе 25—50 р; по числу выклюнувшихся уродливых личинок эти различия отмечались, в зависимости от условий опыта, соответственно при дозах 50 и 200 р, а по общему числу выклюнувшихся личинок различия заметны лишь, начиная с дозы 200 р. Следовательно хромосомные аберрации в клетках зародышей щуки являются несколько более чувствительным критерием радиобиологической реакции по сравнению с другими рассмотренными критериями. При облучении икры линя в диапазоне доз от 25 до 200 р общий процент выклева личинок не изменяется, однако выход личинок с различными признаками морфологических аномалий заметно увеличивается уже при дозе 50 р. Доза облучения в 400 р, так же как и для икры щуки при температуре воды 20°, оказалась абсолютно летальной; полная гибель эмбрионов в этом варианте опыта отмечалась перед самым выклевом их из икры. При дозе 800 р эмбрионы погибали на стадии поздней гаструлы, а при дозе 1200 р — на стадии начала гаструляции (примерно через 5 час. после облучения). Наблюдениями за выживаемостью выклюнувшихся личинок установлено, что гибель личинок из икры, облученной в дозе 200 р, происходит значительно быстрее, чем в контроле. При дозах облучения от 25 до 100 р разница между выживаемостью опытных и контрольных личинок недостоверна. Можно предположить, что внешне нормальные личинки, выклюнувшиеся из икры, облученной относительно малыми дозами, несут в себе скрытые лучевые повреждения, которые скажутся на выживаемости эуих личинок после дополнительного их облучения массивной дозой. Для проверки этого предположения были проведены специальные опыты. Из общей массы личинок двухдневного возраста, выклюнувшихся из необлученной икры и облученной в дозах 25, 50, 100 и 250 р, отобрали по 200 личинок внешне нормальных и разделили их на две группы по 100 шт. в каждой. Одну группу подвергли облучению в дозе 4000 р, а другую оставили в качестве контроля (повторно не облучали). В течение последующих десяти дней учитывали выживаемость этих личинок.
Можно заметить, что без дополнительного лучевого воздействия выживаемость снижается лишь у личинок, которые выклюнулись из икры, облученной в дозе 250 р. В вариантах же с облучением икры в дозах 25 и 100 р относительное число выживших личинок было даже несколько больше, чем в контроле. На фоне дополнительного облучения в дозе 4000 р все личинки, выклюнувшиеся из контрольной икры, к десятому дню после лучевого воздействия погибли. Такой же эффект отмечен при облучении икры в дозе 250 р. При дозах 25, 50 и 100 р выживаемость личинок после дополнительного облучения составляет довольно значительную величину с максимумом (78%) при дозе 25. Таким образом, предполагаемые нами скрытые лучевые эффекты, которые должны возникать при облучении икры относительно малыми дозами, не только не снизили выживаемости выклюнувшихся из этой икры личинок после дополнительного их облучения в сублетальной дозе, а наоборот, оказали заметное радиозащитное действие, аналогичное тому, что отмечалось нами в предыдущем разделе на семенах гороха и сосны. По-видимому, радиозащитное действие малых доз излучений имеет общебиологическое значение, тесно связанное, как уже упоминалось, с механизмом радиостимуляции.