Радиоиммунный анализ (РИА) — высокоточный и один из самых чувствительных методов.
РИА как количественный метод, в отличие от многих традиционных, применим для анализа любого химического вещества, против которого могут быть получены специфические антитела. Чувствительность РИА — нано — и пикограммовые количества исследуемого вещества. Метод позволяет исследовать большое количество проб в минимальном объеме и в относительно короткие сроки (несколько часов), производить количественный учет результатов, он легко подвергается полной или частичной автоматизации.
С помощью РИА можно исследовать любой заразный материал, который предварительно обезврежен: суспензии органов животных, кровь, объекты внешней среды, материал после обогащения на питательных средах и т. д.
Принцип РИА. Метод РИА обычно проводят по конкурентному типу с использованием меченного иодом-125 (125I) белкового антигена и сыворотки к этому антигену в качестве связывающего агента.
Один из вариантов конкурентного РИА — так называемый метод «позднего добавления меченого антигена». Он заключается в том, что сначала антитела вступают во взаимодействие только с немеченым (измеряемым) антигеном. После определенного времени инкубации в пробу добавляют меченый антиген и проводят повторную инкубацию. Этот прием позволяет повысить чувствительность конкурентного РИА, однако основная биологическая суть его при этом не меняется.
Подобрав подходящую систему для отделения свободной (Аг*) и связанной радиоактивности (Аг* — Аг) и произведя сравнение радиоактивности в пробах, содержащих конкурирующий антиген и не содержащих его, можно обнаружить наличие искомого антигена в неизвестном образце. Для отделения связанной и несвязанной радиоактивности используется принцип преципитации комплекса Аг* — Аг суспензией клеток стафилококка, содержащего протеин А. Чем меньше радиоактивность связанной фракции в неизвестных образцах по сравнению с отрицательным контролем (проба без конкурирующего антигена), тем больше искомого антигена присутствует в пробе. Количественное содержание антигена в пробе определяют по калибровочной кривой путем обычной экстраполяции. Для построения калибровочной кривой одновременно с неизвестными образцами исследуют пробы, содержащие известные количества стандартного немеченого антигена.
Материалы и оборудование. 1. Иодид натрия (без носителя) продукт «Б» в щелочном растворе с радиоактивным изотопом 125I с объемной активностью не менее 100 мк/мл (производство С.-Петербургского объединения «Изотоп», ТУ 957070—74). 2. Хлорамин Т (Serva, Германия). 3. Метабисульфит натрия. 4. Хлорид натрия (ГОСТ 4233—66). 5. Фосфат натрия двузамещенный (ГОСТ 11773—66). 6. Фосфат натрия однозамещенный (ГОСТ 245—66). 7. Иодид калия. 8. Азид натрия (Serva, Германия). 9. Формалин 37%-й технический (ГОСТ 16225—61). 10. Спирт-ректификат. 11. Вода дистиллированная и бидистиллированная. 12. Бычий сывороточный альбумин (Serva, Германия). 13. Сефадекс G-200 (Pharmacia, Швеция). 14. Тритон Х-100 (Merk, Германия). 15. Пробирки из кварцевого стекла. 16. Пипетки стеклянные на 1, 2, 5 и 10 мл. 17. Автоматические пипетки на 5, 10, 20, 100 мкл с регулируемым объемом и на 1000 мкл со сменными наконечниками одноразового пользования. 18. Пластиковые пробирки с пробками одноразового пользования. 19. Приспособление для отсасывания жидкости (водоструйный насос с ловушкой для сбора жидкости). 20. Холодильник бытовой. 21. Спектрофотометр. 22. Термостат (37 °С). 23. рН-метр. 24. Хроматографическая стеклянная колонка 0,9 х 60 см. 25. Коллектор для сбора фракций любой модели. 26. Низкоскоростная центрифуга с частотой вращения 5000 мин-1 с ротором, позволяющим одновременно центрифугировать большое количество проб. 27. Счетчик радиоактивности для измерения гамма-излучения РИА-ГАММА (LKB, Швеция) или любой другой модели. 28. Высокоочшценный антиген, например капсульный антиген чумного микроба Ф1, полученный (Baker et al., 1952) путем четырехкратного переосаждения сульфатом аммония, стандартизированный спектрофотометрически и лиофильно высушенный. Антиген Ф1 должен образовывать одну линию преципитации в РИД с гипериммунной противочумной сывороткой. При иммунизации этим антигеном кроликов должны образовываться только специфические антитела. 29. Моноспецифическая кроличья сыворотка против Ф1; не должна образовывать зону преципитации в РИД с бесфракционными штаммами Y. pestis. 30. Стафилококковый реагент, содержащий протеин А, или убитая взвесь клеток стафилококка штамма Cowan-1.
Примечание. 1. Всю посуду, колонки, наконечники для пипеток, используемые в работе, обязательно обрабатывают 1%-м раствором БСА не менее 30 мин на холоде с последующей тщательной отмывкой дистиллированной водой для устранения неспецифической сорбции антигенов и антител.
2. Для реакционной смеси при иодировании антигена используют специально предназначенные для РИД пробирки из кварцевого стекла или тонкие стеклянные пробирки с силиконовым покрытием. Все остальные реакции проводят в пластиковых пробирках одноразового пользования.
3. Антиген Ф1 используют как для метки 125I, так и в качестве стандартов при построении калибровочных кривых.
4. Иммунные сыворотки могут быть получены по любой схеме, включающей внутрикожные инъекции антигена с адъювантом.
5. Необходимо строго придерживаться критериев чистоты антигенов и антител, приведенных выше, так как от этого зависит специфичность анализа.
6. Суспензию стафилококков перед анализом следует отмыть в 0,5…1%-м растворе БСА для снижения неспецифической сорбции.
7. Для метки антигена используют 0,15 и 0,5 М фосфатный буферный раствор (pH 7,4…7,5), приготовленный на бидистиллированной воде. Для очистки меченого антигена и постановки РИА можно применять ФБР на дистиллированной воде.
Иодирование антигена Ф1. Перед меткой антигена предварительно готовят колонку (0,9 х 60 см) с сефадексом G-200, уравновешенную 0,15 М ФБР (pH 7,5).
На колонку наносят 0,2 мл 10%-го раствора БСА, после чего ее промывают тем же буфером с 0,02 % азида натрия.
В стеклянную пробирку из кварцевого стекла вносят следующие реагенты: 10 мкл 0,5 М ФБР (pH 7,5); 2 мкл исходного раствора Na125I в объеме 10…15 мкл; 1,25 мкл раствора антигена Ф1 в объеме 10 мкл; 10 мкл свежеприготовленного раствора хлорамина-Т из разведения 2 мг/мл. Смесь интенсивно перемешивают пипеткой в течение 30 с и добавляют 10 мкл свежеприготовленного раствора метабисульфита натрия из разведения 5 мг/мл. Затем опять интенсивно перемешивают пипеткой в течение 60 с и вносят 350 мкл раствора иодида калия из разведения 0,5 мг/мл. Далее смесь перемешивают и наносят на колонку. В пробирки для сбора фракций предварительно закапывают по 100 мкл 1%-го раствора БСА на 0,15 М ФБР (pH 7,5) с 0,02 % азида натрия.
Элюирование проводят тем же буфером и со скоростью 5…6 капель в 1 мин; собирают фракции по 1 мл. Из каждой фракции отбирают аликвоту, т. е. точно отмеренное количество образца, по 10 мл для подсчета радиоактивности. Радиоактивность измеряют на гамма-счетчике в режиме счета 1251 и 3…4 фракции первого пика, содержащие меченый антиген с уровнем радиоактивности не ниже 200 000 имп./мин в 10 мкл аликвоты, объединяют и используют в работе.
Меченый антиген разводят элюирующим буфером с 0,1 % БСА до 10 000 имп./мин, разливают по 0,5 мл в пластиковые пробирки с крышками и хранят в морозильной камере бытового холодильника до использования.
Построение кривой разведения сыворотки. Определяют рабочее разведение сыворотки в РИА по 50%-му связыванию меченого антигена. Кривую разведения сыворотки строят по данным инкубации фиксированного количества меченого антигена с различными количествами антител, представляющими собой серийные разведения сыворотки. После инкубации измеряют распределение между свободной и связанной фракциями.
Для построения калибровочной кривой подбирают рабочее разведение сыворотки, при котором связывается приблизительно 50 % метки, что обеспечивает максимальную чувствительность анализа. На этом этапе определяют также иммунологическую активность меченого антигена по максимальному связыванию в избытке антител.
Для постановки РИА используют 0,1 М ФБР (pH 7,4…7,5) с 0,5 % БСА, 0,2 % тритона Х-100 и 0,02 % азида натрия (разводящий буфер).
Анализ включает следующие операции.
1. Готовят серию из 10 стандартных разведений сыворотки против антигена Ф1 в 1 мл разводящего буфера от 1:20 000 до 1 : 20 000 000.
2. В двойной ряд пластиковых пробирок разливают по 100 мкл разводящего буфера. Затем вносят по 100 мкл материала, который предполагается исследовать в РИА, но заведомо не содержащего антигена Ф1 и антител к нему. Например, суспензию внутренних органов незараженных животных, желательно того же вида, что и исследуемые на присутствие антигена Ф1, или же нормальную сыворотку, если предполагается исследовать сыворотку от больных.
3. В каждую пробирку добавляют по 20 мкл раствора меченого антигена Ф1, разбавленного разводящим буфером из такого расчета, чтобы общее количество импульсов на пробу за 1 мин было в пределах 15 000…20 000. Для определения общей радиоактивности одну пару пробирок заполняют только раствором, содержащим меченый антиген (контроль ТОТА).
4. В пробирки добавляют по 10 мкл иммунной сыворотки каждого разведения; одна пара пробирок содержит буфер без иммунной сыворотки и служит в качестве холостой пробы, представляющей собой контроль на неспецифические связывания (контроль BLAN).
5. Пробирки инкубируют в течение 18 ч при 4 °С.
6. Во все пробирки (за исключением ТОТА) добавляют по 100 мкл 20%-й суспензии стафилококка. Выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре при периодическом осторожном встряхивании.
7. Добавляют по 1 мл разводящего буфера.
8. Центрифугируют в течение 5 мин при частоте вращения 4000…5000 мин-1.
9. Надосадочную жидкость осторожно сливают или удаляют, стараясь не повредить осадок стафилококков. Лучше удалять жидкость пастеровской пипеткой, соединенной с водоструйным насосом.
10. Пробирки просчитывают в гамма-счетчике в течение 60…120 с.
11. Вычисляют среднее значение счетности из каждых двух параллельных проб.
12. Из средней величины счетности проб с серийными разведениями сыворотки вычитают среднюю величину счетности контроля BLAN.
13. Вычисляют иммунологическую активность меченого антигена. Для этого величину счетности пробы с наибольшим связыванием делят на величину счетности общей добавленной радиоактивности (ТОТА). Этот показатель должен находиться в пределах 0,4…0,7, что свидетельствует о хорошем качестве меченого антигена.
14. Строят график, откладывая на оси ординат процент связанной метки, а по оси абсцисс — логарифм разведенной иммунной сыворотки. При этом за 100 % принимают счетность пробы с наибольшим связыванием в присутствии избытка антител.
15. Определяют графическим способом то разведение иммунной сыворотки, которое связывает 50 % меченого антигена.
Примечание. При использовании гамма-счетчика, управляемого микропроцессором типа РИА-ГАММА (LKB-Wallak, Швеция), все операции, начиная с просчета проб до построения кривой разведения сыворотки, проводятся автоматически по заданной программе расчета согласно руководству по эксплуатации счетчика.
Определение неизвестного количества антигена Ф1 в пробах по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой проводят инкубацию фиксированных количеств меченого антигена Ф1 и иммунной сыворотки в рабочем разведении с различными концентрациями чистого немеченого антигена. Кривая, построенная в координатах процент связанной метки — логарифм серийных разведений антигена, имеет сигмовидный характер. Верхняя часть кривой соответствует таким малым количествам немеченого антигена, которые вызывают относительно небольшие сдвиги в распределении метки между свободной и связанной фазами. В нижнем участке кривой соотношение между суммарными концентрациями антигена и антител таково, что большая часть антигена находится в свободной форме.
Между этими двумя экстремальными ситуациями имеется интервал концентраций антигена, в пределах которого относительно небольшие изменения вызывают значительные сдвиги и в распределении антигена между свободной и связанной фазами.
Построение калибровочной кривой — основное условие количественного определения антигена Ф1 в исследуемом образце.
Если вместо стандарта взять исследуемый образец и использовать те же фиксированные концентрации антител и метки, то найденное распределение метки между связанной и свободной фазами будет соответствовать некой величине на горизонтальной оси калибровочной кривой. Эту величину определяют путем простой экстраполяции.
Подготовка исследуемого материала. Кусочки паренхиматозных органов животных размером 0,5 х 1 см переносят в стерильную ступку со стерильным кварцевым песком, тщательно растирают, добавляя до 10 мл буфера для РИА или 0,9%-го раствора хлорида натрия, содержащего 1 % формалина.
После отстаивания суспензии надосадочную жидкость отбирают через ватный тампон в стерильные пробирки. После трехкратного замораживания при —10 °С с оттаиванием исследуемый материал инактивируют при 56 °С в течение 30 мин. После этого делают контрольный высев на стерильность; при отрицательных результатах суспензию исследуют в РИА.
Аналогичным образом готовят пробы от павших животных, суспензии из эктопаразитов, пробы из объектов внешней среды и т. д. Кровь или сыворотку разводят буфером для РИА из расчета 1 : 10.
Пробы со стандартными разведениями немеченого антигена Ф1 должны содержать материал, аналогичный по химическому и биологическому составу исследуемому, но без примесей определяемого антигена и антител к нему. Например, при исследовании суспензий органов зараженных животных нужно приготовить суспензии органов интактных животных того же вида, при исследовании сыворотки от зараженных животных необходимо располагать нормальной сывороткой, свободной от антигена Ф1.
Такие контрольные пробы должны быть приготовлены так же, как описано выше.
Следует учитывать, что чем больше контрольные пробы будут соответствовать по своему химическому составу опытным, тем более точным и достоверным будет результат.
Проведение РИА. Все реагенты разводят буфером для РИА.
Анализ включает следующие операции.
1. Готовят серии из 10 стандартных разведений немеченого антигена Ф1 в 1 мл разводящего буфера от 20 пг/мл до 20 нг/мл.
2. В двойной ряд пластиковых пробирок разливают по 100 мкл стандартных растворов немеченого антигена каждого разведения.
3. Вносят по 100 мкл субстрата, который предполагается исследовать в РИА, но заведомо не содержащего антигена Ф1 и антител к нему. Кроме того, готовят двойной ряд пробирок, содержащих свободный от антигена Ф1 субстрат без стандартного антигена Ф1; одна пара этих пробирок служит в качестве «холостой пробы» (BLAN), а другая — в качестве «нулевого стандарта» пробы с максимальным связыванием меченого антигена (REFR), а в остальные дублированные пробирки разливают по 100 мкл исследуемого материала.
4. В каждую пробирку приливают по 100 мкл иммунной сыворотки к антигену Ф1 в рабочем разведении. В «холостые пробы» (BLAN) вместо иммунной сыворотки добавляют по 100 мкл буфера.
5. Пробирки инкубируют в течение 18 ч при 4 °С (1-я инкубация).
6. В каждую пробирку добавляют по 20 мкл раствора меченого антигена Ф1, разбавленного разводящим буфером точно так же, как при построении кривой разведения сыворотки. Для определения общей радиоактивности одну пару пробирок заполняют только раствором, содержащим меченый антиген (ТОТА).
7. Инкубируют в течение 6 ч при 37 °С (2-я инкубация).
8. Во все пробирки (за исключением ТОТА) добавляют по 100 мкл 20%-й суспензии стафилококков и проводят дальнейшую обработку (см. построение кривой разведения сыворотки).
9. Просчитывают радиоактивность осадка во всех пробах за 60…120 с.
10. Вычисляют среднее значение счетности из каждых двух параллельных проб.
11. Из средней величины счетности проб со стандартными разведениями немеченого антигена REFR и проб с исследуемыми образцами высчитывают среднюю величину счетности контроля BLAN.
12. Вычисляют иммунологическую активность меченого антигена аналогично методу, описанному ранее. Для этого величину счетности делят на величину счетности ТОТА. Если эта величина приближается к величине стандартной калибровочной, то это свидетельствует о правильности проведения анализа.
13. По результатам, полученным при исследовании стандартов, строят график, откладывая по оси ординат процент связанной метки, а по оси абсцисс — логарифм концентрации стандартного антигена. При этом за 100 % принимают пробы с наибольшим связыванием (REFR).
14. Рассчитывают количество антигена Ф1 в исследуемых образцах.
Результаты исследования неизвестного образца сравнивают со стандартной калибровочной кривой и путем экстраполяции вычисляют количество искомого антигена, содержащегося в пробе.
Количество (%) связавшейся радиоактивности в стандартных и исследуемых пробах вычисляют по формуле
Связавшаяся радиоактивность = (B — BLAN):(REFR — BLAN)∙100 %,
где B — счетность исследуемой пробы или стандарта; BLAN — счетность пробы с неспецифическим связыванием; REFR — счетность пробы с максимальным связыванием без конкурирующего антигена Ф1.
Примечание. При использовании гамма-счетчика, управляемого микропроцессором, подсчет проб, построение калибровочной кривой, определение концентрации антигена Ф1 в исследуемом образце проводится автоматически и результаты выдаются в распечатанном виде. Программирование проводят согласно руководству по эксплуатации счетчика.
Аналитическая характеристика материала. 1. Время проведения анализа составляет 25…26 ч в зависимости от количества исследуемых проб. Опыт можно сократить до 6…7 ч, если 1-ю и 2-ю инкубации проводить в течение 2 ч при 37 °С. Однако чувствительность метода снижается в несколько раз.
2. Если нет необходимости в быстром получении результата, то 2-ю инкубацию можно проводить в течение 18 ч при 4 °С без потери чувствительности анализа.
3. При высоком содержании антигена Ф1 в пробах (больше 20 нг/мл) будет низкая счетность, выходящая за пределы калибровочной кривой. В этом случае для точного количественного определения антигена исследуемые образцы необходимо разбавить в 10 или 100 раз и повторить исследование заново.
4. Среди результатов анализа возможны ложноположительные. Если позитивный результат дает одна из двух проб данного образца, ответ следует считать отрицательным.
Причины следующие: загрязнение проб материалом позитивных образцов или стандартов; потеря части осадка стафилококков при удалении над осадочной жидкости.
5. Все отрицательные результаты свидетельствуют о том, что в исследуемом образце нет антигена Ф1 либо содержание его ниже порога чувствительности метода.
6. При правильно проведенном исследовании минимальная выявленная с помощью РИА концентрация антигена Ф1 составляет 20 пг/мл исследуемой пробы (1500 м. т./мл).
7. Коэффициент вариации для 10 параллельных определений антигена Ф1 в одном и том же образце не должен превышать 15 % при квалифицированном проведении анализа.
8. Если перерыв между исследованиями неизвестных образцов превышает 7 сут, то при подготовке к очередному анализу следует вновь определить рабочее разведение иммунной сыворотки.
9. Меченый антиген Ф1 может быть использован в течение 2 мес при условии хранения в замороженном виде.
Меры предосторожности при метке антигена и проведении РИА.
1. Na125I и антиген, меченный 125I, являются источником мягкого гамма-излучения. Период полураспада 125I составляет 60 сут.
2. При работе с 125I следует соблюдать правила работы с радиоактивными веществами (РВ) по 3-му классу.
3. Химическая посуда и оборудование, использованные при работе с РВ, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.
4. При работе с РВ на рабочем месте должны отсутствовать посторонние предметы и личные вещи.
5. Категорически запрещается прием пищи, использование косметических средств, курение в помещениях, предназначенных для работы с РВ.
6. Необходимо при работе с РВ использовать резиновые перчатки, а после работы тщательно мыть руки.
7. Жидкие и твердые радиоактивные отходы должны быть помещены в контейнеры с последующим захоронением.
Практическое использование. РИА нашел широкое применение в тех областях биологии и медицины, где важно определить следовые количества веществ: эндокринология, фармакология, токсикология, а также микробиология и вирусология.
Исключительную важность использования РИА для контроля за эффективностью оздоровления природных очагов иллюстрирует следующий пример.
В РИА был исследован полевой материал (суспензии органов диких грызунов, птиц, трупов грызунов), добытый с территории оздоровленного Саглинского мезоочага чумы (Тыва). Обработка ДДТ территории очага привела к резкому снижению численности эктопаразитов и прекращению эпизоотического процесса. Результаты контрольных исследований носителей и переносчиков с оздоровленной территории, проведенные стандартными методиками, были неизменно отрицательными. Всего радиоиммунологическому анализу подвергнуто с этой территории 125 объединенных проб от 642 грызунов, 10 птиц и 2 трупов павших грызунов. Специфический чумной антиген был обнаружен в 28 % проб. Обследование грызунов в РИА с контрольной неэнзоостийной в прошлом территории дало негативные результаты. Оздоровление Саглинского мезоочага чумы следовало считать условным. На следующий год это было подтверждено шестью серопозитивными пробами РИГА — РНАг с указанной территории. Таким образом, РИА как наиболее чувствительный метод превосходит возможности стандартных серологических тестов, что позволило обнаружить следовые количества чумного микроба у грызунов.
То обстоятельство, что серологические методы нового поколения (РИА, ХЛИА, ИФА) значительно превосходят по чувствительности РИГА и ее модификации, а также бактериологический метод — факт широко известный и всеми признаваемый. Поэтому их следует рекомендовать наряду со стандартными тестами для контроля за эффективностью оздоровительных мероприятий в природных очагах чумы. Полностью подтвердили преимущество РИА обследования основного носителя — горного суслика в Центрально-Кавказском природном очаге чумы; антиген был выявлен в большем числе случаев. У экспериментально зараженных горных сусликов специфический антиген обнаруживали в течение 279 сут.
РИА с успехом применяется в ветеринарии для обнаружения бруцелл (М. Serrano et al., 1987), вируса африканской чумы свиней (Е. Tabares et al., 1987) и других микроорганизмов.