Первые попытки Кайетэ и Пиктэ сжижать атмосферные газы не имели успеха. Эти авторы не получили жидкости в измеримом объеме, а смогли лишь превратить газы в туман в условиях очень низких температур.
Тем не менее Пиктэ и сотрудники испытывали действие полученной таким путем холодной среды на бактерии различных видов и обнаружили, что последние переживали пребывание при температуре —70° в течение 3 дней, а при —120° в течение 36 час. Аналогичные опыты были проведены на семенах, которые впоследствии проросли. Де Кандоль пришел к выводу, что метаболическая активность вряд ли возможна в организмах, подвергающихся воздействию очень низких температур, и сравнил их с взрывчатыми смесями, хранящимися при таких температурах, при которых компоненты этих смесей утрачивают способность взаимодействовать.
В 1900 г. Линде и Дьюар получили уже в больших объемах жидкий воздух, жидкий азот и жидкий водород. Макфэдиен, работавший в лаборатории Дьюара, выдерживал культуры 10 различных организмов в жидком воздухе при температурах от —182 до —190° в течение 20 час. После оттаивания он получал свежие культуры всех организмов, включая холерный вибрион, а также тифозную и дифтерийную палочки. У Proteus vulgaris и Escherichia coli наблюдались обычные биохимические, в том числе и ферментативные, реакции.
Staphylococcus aureus сохранял способность образовывать пигмент, а бациллы сибирской язвы и их споры оставались патогенными для животных. Светящиеся бактерии Bacillus phosphorescens и Photobacterium balticun в замороженном состоянии не светились, но после оттаивания интенсивность свечения у них, по-видимому, не снижалась и в культурах восстанавливалась нормальная функциональная активность. Последующие опыты показали, что жизнеспособность этих и многих других микроорганизмов, включая дрожжи, не пострадала после пребывания в течение 7 дней при температуре —190°. Когда большой объем воздуха сгустили в стеклянном баллоне до жидкого состояния, а затем дали ему испариться, температура упала до —210°. Тем не менее в остаточной среде в баллоне были обнаружены 44 вида микроорганизмов, в том числе плесневые грибы, бациллы, кокки и дрожжи.
Эти первые опыты наглядно показали, что самые различные виды бактерий и других микроорганизмов способны переживать охлаждение и хранение в замороженном состоянии при очень низких температурах. Постепенно, однако, стало ясным, что чувствительность микроорганизмов к замораживанию и оттаиванию сильно варьирует в зависимости от принадлежности их к тому или иному виду. Накапливались данные о том, что при температуре ниже нуля большинство кишечных и тифозных палочек, а также других микроорганизмов погибает.
Процент выживающих организмов зависел от индивидуальных особенностей различных видов, от продолжительности хранения при данной температуре и от среды, в которой они были взвешены. Кейт показал, что при замораживании кишечной палочки и хранении ее при температуре —20° в обыкновенной воде через 5 дней оставалось менее 1% жизнеспособных бактерий, а через несколько недель они все погибали. В противоположность этому большой процент бактерий пережил охлаждение до этой же температуры не в воде, а в молоке. Если молоко разбавляли, процент смертности увеличивался. Кейт сделал еще одно важное наблюдение: когда готовили взвесь кишечной палочки
в смесях, содержащих 5—42% глицерина, большое число их переживало хранение при температуре —20° в течение не менее 6 месяцев. Он нашел также, что исходные культуры многих микроорганизмов, в том числе Bacillus subtilis, В. megaterium, В. proteus и Sarcinae, переживают воздействие температуры —10° при посеве на косом агаре, покрытом 10-процентным раствором сахарозы. В течение примерно 40 лет исследователи, по-видимому, не вспоминали о защитном действии глицерина на бактерии, находящиеся в частично замороженной среде. Систематические испытания стали проводить вновь только после появления сообщений о консервации сперматозоидов и эритроцитов при очень низких температурах в средах, содержащих глицерин.
В этих первых опытах большое число микроорганизмов погибало в процессе замораживания, тогда как во время хранения при любой температуре смерть наступала не так быстро. Чем ниже была температура хранения, тем позднее погибали организмы. Последующие опыты заставили предположить, что в некоторых случаях на выживание бактерий после замораживания, особенно в условиях очень низких температур, влияла скорость охлаждения и согревания. Нет данных, что переживание зависит от витрификации. Действительно, чрезмерно быстрое охлаждение до очень низких температур сопровождалось высоким процентом гибели кишечной палочки, тогда как снижение скорости охлаждения увеличивало долю микроорганизмов, переживших медленное согревание. Наиболее высокий процент гибели, согласно Вейзеру и Харгису, наблюдался при чрезмерно быстром охлаждении с последующим медленным оттаиванием. Эти авторы, по-видимому, не испытывали действия на кишечную палочку медленного охлаждения и быстрого согревания. Быстрое оттаивание обычно являлось существенной предпосылкой для восстановления максимального числа жизнеспособных бактерий. Очевидно, повреждения, возникающие во время хранения при любой температуре, следует отличать от повреждений, которые появляются в процессе замораживания и оттаивания. К числу других факторов, влияющих на выживание после кратковременного или длительного воздействия низких температур, нужно отнести возраст культуры, концентрацию в ней микроорганизмов, состав суспензионной смеси или культуральной среды.
Сэндерсон одним из первых выявил влияние повторного замораживания и оттаивания на число жизнеспособных клеток в культуре. Когда культуру Escherichia coli охлаждали до —78° и затем оттаивали, 84% микроорганизмов переживало один цикл охлаждения и оттаивания, тогда как только 10% переживало 10 циклов и лишь 6% микроорганизмов переживало 15 циклов охлаждения и оттаивания. Неоднократно замораживаемые и согретые различные бактериофаги не утрачивали активности. В то же время Риверс показал, что бактериофаг кишечной палочки в результате неоднократного замораживания и оттаивания утрачивал активность по крайней мере на 99%. Процент разрушенных фаговых частиц заметно возрастал при разбавлении фильтрата физиологическим раствором или раствором Локка. Другие вирусы также инактивировались при соответствующем числе циклов замораживания и оттаивания. Вирус коровьей оспы отличался большой устойчивостью, однако и его фильтрат, разбавленный в 100 000 раз физиологическим раствором, терял свою активность после 34-го цикла замораживания до —185° и последующего оттаивания. Инактивация комплемента сыворотки и трипсина посредством многократного замораживания и оттаивания показывает, что такая инактивация не представляет собой свойства исключительно живых организмов, как полагал Сандерсон.
К 1949 г. уже существовала обширная литература, посвященная влиянию замораживания и оттаивания на бактерии различных родов и видов. Многие работы вошли в литературный обзор, составленный Энгли. Некоторые из них были предприняты с целью выяснения оптимальных условий храпения пищевых продуктов на холоду. Здесь следовало иметь в виду два обстоятельства. Во-первых, во время хранения пищи или культур в течение продолжительного времени при температуре ниже нуля некоторые виды микроорганизмов размножаются. Если не понизить температуру до уровня,
несовместимого с их ростом, эти микроорганизмы могут изменить вкусовые качества и внешний вид пищевых продуктов или выработать токсические вещества. Во-вторых, иногда небольшое число патогенных микроорганизмов может пережить охлаждение и начать размножаться уже после согревания или после попадания их в организм человека с едой. Задача других опытов заключалась в разработке методов хранения бактериальных культур in vitro, позволяющих избегать дополнительного труда, расходов и осложнений, связанных с многократным пересевом или пассажами на животных. Некоторые виды микроорганизмов оказались крайне чувствительными к замораживанию и оттаиванию и, по-видимому, неспособными их переживать. Другие сохраняли жизнеспособность при замораживании до низких температур или после лиофилизации. Однако в обоих случаях процент смертности бактерий был очень высок.
Для определения факторов, влияющих на разрушение бактерий при низких температурах, было проведено много капитальных физиологических исследований. У некоторых организмов повреждения наступали при резком охлаждении их до температуры ниже нуля в критической фазе роста. Однако обычно повреждения происходили в случае замерзания окружающей среды. Так, например, некоторые виды бактерий хорошо переносили переохлаждение до температуры на несколько градусов ниже нуля, не теряя жизнеспособности при согревании, если окружающая их среда не кристаллизовалась. Создается впечатление, что повреждения могут быть двух типов: одни наступают во время замораживания и оттаивания, другие — во время хранения при низкой температуре. В период между 1900 и 1949 гг. высказывались самые различные предположения относительно возможной причины гибели замороженных бактерий. Многие исследователи придерживались выдвинутой Кейтом теории механического повреждения бактерий кристаллами льда, согласно которой кристаллы сдавливают или прокалывают клетки снаружи или же, разрастаясь внутри самой клетки, приводят к ее разрыву. В то же время Хайнс не получил данных, подтверждающих эту гипотезу. Он показал что для Bacillus pyocyancus (Pseudomonas aeruginosa) температура —2° уже является критической. При этой температуре наблюдалась максимальная смертность, хотя микроорганизмы были взвешены в незамороженной среде и не соприкасались с кристаллами льда. Белки бактерий полностью сохранялись как при быстром замораживании и хранении при очень низких температурах, так и при хранении после лиофилизации. Хайнс высказал предположение, что бактерии и их белки чувствительны к концентрации солей или к pH среды, изменяющимся после вымерзания при —2° большей части воды. Другое предположение заключалось в том, что клетки, находившиеся в частично замерзшей среде при относительно высоких температурах, погибали вследствие накопления продуктов обмена; при низких же температурах смерть наступала позже вследствие замедления метаболических процессов.
Вейзер и Остеруд не согласны с тем, что образование кристаллов льда внутри клеток обусловливает их гибель во время замораживания. Клетки погибали при температуре выше той, при которой можно было бы ожидать кристаллизации цитоплазмы. Вейзер и Харгис, по-видимому, не сомневаются в том, что при образовании льда вне клеток при температуре ниже —110° внутреннее содержимое бактерий переходит в стекловидное состояние. Эти авторы полагают, что механическое действие внеклеточного льда служит основной причиной гибели бактерий во время замораживания, поскольку наибольшая смертность наблюдалась в последних стадиях кристаллизации, когда слой жидкости между отдельными кристаллами уменьшался и не мог предохранить клетки от сдавливания. По их мнению, существуют различные факторы, способствующие гибели бактерий во время хранения при низких температурах. Они нашли, что при —30° смертность резко понижалась, и считают, что эта температура совпадает с эвтектической точкой, когда выделяются последние остатки воды и солей. Ниже этой температуры клетки уже не подвергаются воздействию концентрированных электролитов. Вейзер и Остеруд высказали предположение, что повышенная концентрация растворенных веществ в жидкости между кристаллами может служить одним из факторов, способствующих гибели бактерий во время хранения их при температурах выше эвтектических точек для различных солей, присутствующих в данной среде.