Размножение клеток

Процесс размножения клеток является основой всего морфогенеза, так как он поставляет материал для последующего роста и дифференциации клеток.

Собственно говоря, для возникновения морфологических структур достаточно одного процесса размножения клеток, которое управляется путем торможения или стимуляции его в разных направлениях. Процессы растяжения клеток и их дифференциации имеют уже скорее значение в том, чтобы возникшие структуры были жизнеспособными и могли функционировать в составе целого растения. Поэтому, рассматривая роль фитогормонов в морфогенезе растений, необходимо в первую очередь обратиться к вопросу о том, как с помощью фитогормонов регулируется размножение клеток.

В настоящее время считается, что подготовку клеток к делению и митоз можно рассматривать как циклически повторяющийся процесс развития клеток; каждый отдельный такой цикл называется митотическим. Во время осуществления клетками этого цикла в разные его периоды происходят синтезы белков, специфичных для того или иного этапа, и синтезы различных информационных РНК, необходимых для построения этих белков, т. е. последовательность развития клетки в процессе подготовки ее к делению определяется последовательностью транскрипции и трансляции части наследственной информации, управляющей размножением клеток.

Следует отметить, что помимо белков, синтезируемых на определенных этапах подготовки к делению (фазоспецифичных) существуют белки, которые синтезируются в течение всего периода подготовки к делению (конститутиивные), которые необходимы для поддержания клетки в живом состоянии. Поэтому процесс подготовки клеток к делению разыгрывается на фоне непрерывного синтеза конститутиивных белков, и синтез фазоспецифичных белков является лишь частью общего белкового синтеза.

Самое замечательное в этой последовательности — это ее замкнутость, которая достигается тем, что конечное состояние является в то же время исходным для нового цикла. При другом типе развития клеток — дифференциации, конечное состояние является действительно конечным, так как оно может измениться лишь при гибели клеток или когда их возвращение в исходное состояние можно вызвать искусственно.

Последовательность использования генетической информации в процессе подготовки клеток к делению, по-видимому, не является автономной, а нуждается во внешних, цитоплазматических индукторах. По предположению Стерна, митотический цикл, или макроцикл, можно разбить на целый ряд микроциклов. Каждый микроцикл включает в себя синтез на ДНК информационной РНК под влиянием цитоплазматического индуктора, образование фазоспецифичного белка, образование под влиянием ферментативной активности этого белка индуктора или индукторов, которые прекращают деятельность дерепрессированного участка ДНК и активируют новый, следующий участок.

Регулирование деления клеток в организме достигается за счет создания условий, благоприятствующих делению клеток в одних участках и подавляющих этот процесс в других. Наиболее вероятным способом такого регулирования может быть наличие в общей последовательности таких микроциклов, которые осуществляются при участии внеклеточных индукторов, в большинстве случаев гормональной природы. Под внеклеточным индуктором следует понимать индуктор, не возникающий в делящейся клетке, а поступающий в нее из других клеток организма. Хотя регулирование с помощью влияния на синтез конститутивных белков мы можем себе представить, оно менее вероятно.

При отсутствии внеклеточного гормонального индуктора цепь микроциклов прерывается, и клетки не могут завершить митотический цикл (макроцикл). Поэтому с помощью управления распределением в теле организма этого (или этих) (индуктора (индукторов) может осуществляться управление размножением клеток. Одним из доказательств этого служит тот факт, что клетки опухолевых тканей, не подчиняющиеся регулирующему воздействию организма, в большинстве случаев не нуждаются в гормонах для размножения, т. е. являются в этом смысле автономными.

Широко известно, что клетки растительных опухолей способны размножаться на питательных средах без ауксинов и цитокининов. Согласно имеющимся данным, эта автономность обусловлена способностью к самостоятельному синтезу фитогормонов, которые, таким образом, из внеклеточных индукторов превращаются во внутриклеточные.

Если фитогормон выступает как фактор, необходимый для осуществления лишь какого-то этапа митотического цикла, то можно ожидать, что в отсутствие фитогормона клетки, не прошедшие этот этап, остановятся в процессе подготовки к делению перед ним, а клетки, которые к моменту исчезновения фитогормона уже прошли этот этап, завершат митотический цикл делением, но две дочерние клетки также остановятся перед этим этапом. Таким образом, через некоторое время (не менее продолжительности одного митотического цикла) все клетки популяции будут находиться в одинаковой фазе митотического цикла, т. е. будут синхронизированы. Если после некоторого периода отсутствия фитогормона дать его вновь, то эта синхронизация выявится в более или менее одновременном осуществлении клетками первого и, может быть, нескольких последующих делений. В случае фазоспецифичного действия через некоторое время все клетки скапливаются перед зависящим от гормона этапом митотического цикла. При введении гормона в среду обнаруживается синхронизация делений. В случае неспецифичного действия фитогормона распределение клеток по фазам митотического цикла не изменяется. Скорость осуществления митотического цикла либо уменьшается, либо равняется нулю. При введении гормона возобновляется экспоненциальный рост популяции.

В нашей работе с суспензионной культурой ткани табака мы показали, что после выдерживания ткани в течение 2—3 суток на среде без ауксина (НУК) количество клеток в суспензии переставало увеличиваться. Если в среду затем добавляли НУК, то в период между 8 и 12 часами после ее добавления происходило увеличение количества ДНК, а в период между 16 и 20 часами наблюдалось увеличение количества клеток. После первого синхронизированного деления мы наблюдали второе (дальше опыты не проводились). Эти факты позволили нам предположить, что ауксин необходим на каком-то одном этапе митотического цикла, и что этот этап находится где-то в периоде G₁.

Можно предположить, что такой фазоспецифичный характер действия на митотический цикл клеток присущ не только ауксину, но и другим гормонам, в том числе и гормонам животных, в тех случаях, когда они действуют на деление клеток. Так, в работах Сакса и Ланга показано, что индуцированные гиббереллином деления клеток в субапикальной меристеме стебля в какой-то степени синхронизированы. Так как первое синхронизированное деление происходило через 24 часа после обработки, то высказывалось предположение, что действие гиббереллина может быть приурочено к началу периода G₁. Однако других данных, более четко выявляющих характер действия гиббереллина на митотический цикл, не было представлено.

При индукции стрелкования у горчицы одним длинным днем вначале происходило резкое увеличение митотического индекса, а уже через 12 часов после этого увеличение количества меченых ядер. Так как действие фотоиндукции длинным днем состоит в увеличении количества эндогенных гиббереллинов, то эти данные можно рассматривать как подтверждение того, что гиббереллин и в данном случае выступает в качестве фазоспецифичного индуктора деления, только в этом случае его действие приурочено к периоду G₂.

Сходная картина в действии на деление клеток наблюдается при сравнении приведенных наших данных относительно ауксина и данных по действию эстрогенов на клетки эпителия матки мышей с удаленными яичниками. В работе этих авторов мышам вводили 17 β-эстроген, или местранол, затем в различные промежутки времени Н³-тимидин на 45 минут, потом фиксировали эндометрий и определяли процент меченых ядер. Видно, что ход вступления клеток в S-период под влиянием эстрогена очень близок к ходу накопления ДНК в суспензии ткани табака при индукции деления ауксином.

Таким образом, фазоспецифичное действие гормонов на митотический цикл наблюдается во многих случаях.

В настоящее время неизвестно, действуют ли специфично на этот процесс ингибиторы (абсцизиновая кислота, ретарданты, морфактины и т. д.), которые во многих случаях тормозят рост именно за счет подавления размножения клеток.

Фазоспецифичное действие гормонов н-a митотический цикл можно рассматривать как иллюстрацию того положения, что иногда гормон лишь запускает какой-то процесс, а не действует на всем его протяжении. Так, в случае деления клеток можно предполагать существование какого-то одного гормон-зависимого этапа, все последующие реакции митотического цикла, таким образом, зависят от фитогормона косвенно. Поэтому многие изменения в клетках, возникающие после обработки гормонами, в том числе синтезы ДНК, новых РНК и белков, могут быть не непосредственной реакцией на гормон, а следствием осуществившейся первичной реакции.

Рассмотрим конкретные примеры участия фитогормонов в регуляции деления клеток.

Хотя механизм действия ауксина наиболее интенсивно изучается на примере его влияния на рост растяжением клеток отрезков колеоптилей и стеблей, можно считать, что участие ауксина в делении клеток не менее, а может быть, и более значимо в регуляции роста растений, чем его участие в растяжении клеток. Местом наиболее высокой концентрации ауксина в растениях являются делящиеся ткани (концевые меристемы, камбий), и ауксин, вводимый извне, в первую очередь накапливается в них. Можно предполагать, что высокая митотическая активность этих тканей и высокое содержание в них ауксина как-то связаны между собой. Эта связь, вероятно, выражается в том, что ауксин необходим для деления клеток и вырабатывается в делящихся клетках.

Попытки регулировать деление клеток меристем с помощью введения извне ауксина (в большинстве случаев оказались неудачными, так как из-за высокого уровня эндогенного ауксина вводимый извне препарат оказывался избыточным для этих тканей. Однако деление камбия во многих случаях активировалось под влиянием экзогенного ауксина, особенно при совместном применении с гиббереллином или кинетином.

Делящиеся клетки, по-видимому, могут быть источником ауксина лишь тогда, когда они находятся в составе целого растения, так как при их изоляции они сами нуждаются в присутствии в среде ауксина для осуществления размножения клеток. В целом растении источником ауксина или его предшественника для меристематических тканей могут служить молодые листья, так как показано, что введенные в них ИУК-С¹⁴ и триптофан-С¹⁴ передвигаются акропетально и накапливаются в верхушке растения.

Применение ауксинов извне, особенно таких, как 2,4-Д и НУК, может приводить к нарушению упорядоченности делений в зонах роста. В результате этого вместо обычных морфологических структур возникают бесформенные наросты, превращающиеся затем в каллусную ткань. Это явление широко используется для получения культур тканей разных, в том числе и однодольных растений. Сам-по себе факт дезорганизующего влияния ауксинов на упорядоченный ход процесса деления клеток в организме может также рассматриваться как свидетельство в пользу того, что регулирование процесса размножения клеток в организме достигается за счет лимитированного и направленного снабжения клеток ауксином. Когда количество ауксина перестает быть ограничивающим фактором, упорядоченность делений нарушается.

Примерами действия ауксина на деление могут служить корнеобразование, партенокарпическое разрастание завязи, дедифференциация изолированных паренхимных тканей.

Возникает вопрос, что общего в действии ауксина на деление клеток и на их растяжение? Сходство в требованиях к структуре молекулы ауксинов позволяет предположить, что активный комплекс в обоих случаях образуется при участии одного и того же рецептора. Но внутриклеточный уровень, на котором реализуется действие возникшего активного комплекса, может быть различным. Если в случае (растяжения клеток мы можем обойтись без предположения о действии ауксина на генетический аппарат клетки и на аппарат белкового синтеза, то при делении это предположение закономерно и необходимо.

В работах Володарского и Бутенко было показано, что при действии ауксина (совместно с кинетином) на сердцевинную паренхиму стебля табака, приводящем к активации деления клеток, в этой ткани возникают белки, иммунохимически сходные с белками меристематических делящихся клеток целого растения. Влияние ауксина на корнеобразование у черенков растений значительно более чувствительно к ингибиторам синтеза нуклеиновых кислот и белков, чем на растяжение клеток.

В настоящее время имеются данные о том, что большую роль в репликации ДНК и в делении клеток играет ядерная оболочка, а у бактериальных клеток, не имеющих ядра, оболочка клетки. В опытах Комингса и Какефуды синхронизированные клетки амниона человека в культуре инкубировали с Н³-тимидином в течение первых 10 минут S-периода. Последующая электронномикроскопическая циторадиоавтография показала, что начальное включение наблюдалось только в области ядер ной оболочки. Авторы предположили, что участки хромосом, ответственные за начало репликации ДНК (репликоны), присоединены к ядерной оболочке.

Возможно, что роль ауксина в индукции деления клеток связана с его влиянием на ядерную оболочку, тогда действие ауксина на размножение клеток и действие на растяжение имели бы между собой много общего, т. е. в обоих случаях влияли на мембранные структуры.

Сравнение характера зависимости разных процессов, вызываемых одним и тем же агентом, от концентрации этого агента может дать некоторые сведения о сходстве и различии в характере его действия на эти процессы. В отношении влияния ауксина на растяжение клеток известно, что величина реакции зависит от концентрации ауксина в среде. Существует область концентраций, в которой наблюдается линейная зависимость величины реакции от концентрации ауксина. Этот факт используется при полуколичественном определении ауксина в экстрактах с помощью биопробы.

В наших опытах по индукции деления клеток в ткани табака, выдержанной на среде без НУК в течение 2—3 суток, мы испытали, как зависит эта реакция от добавляемой концентрации НУК. Концентрация 0,05 мг/л не вызывает индукции деления клеток, при концентрациях 0,20—2,00 мг/л деление клеток наступает одновременно, и количество клеток, участвующих в первом делении, одинаково. Но при 0,20 мг/л клетки не переходят ко второму делению, тогда как при 2 мг/л осуществляется второе и последующие деления. Таким образом, наши данные позволяют предположить, что концентрация ауксина определяет количество митотипеских циклов, которое сможет совершить клетка, а не скорость прохождения митотического цикла. В отношении первого индуцированного деления реакция на ауксин, по-видимому, осуществляется по принципу «все или ничего», т. е. при концентрациях ниже пороговой реакция не наступает, а при всех концентрациях выше пороговой происходит независимо от концентрации.

Такой характер зависимости индукции деления от концентрации ауксина можно рассматривать как косвенное доказательство фазоспецифичности его действия. Это следует из того, что ауксин выступает как фактор, включающий механизм подготовки к делению при соответствующих концентрациях, а не как фактор, изменяющий скорость прохождения клетками митотического цикла.

Вероятно, схема реакции клеток на ауксин при индукции деления клеток выглядит следующим образом. В клетке существует какое-то количество молекул рецептора ауксина, при этом все молекулы рецептора должны соединиться с молекулами ауксина, чтобы клетка могла продолжать осуществление митотического цикла. Если количество ауксина недостаточно, то реакция не наступает, если же количество ауксина больше, чем требуется для насыщения, то это не оказывает влияния на процесс. В случае же действия ауксина на растяжение клеток степень стимуляции в некоторых пределах пропорциональна концентрации, т. е. для осуществления реакции не обязательно связывание с ауксином всех молекул рецептора.

Следует отметить, что в наших опытах по влиянию разных концентраций ауксина на размножение клеток в асинхронной популяции не было обнаружено зависимости типа «все или ничего». При повышении концентрации увеличивалась скорость накопления клеток в куль туре. Поэтому вопрос о зависимости деления клеток от концентрации ауксина требует дальнейшего выяснения, но для синхронизированной популяции клеток высказанные предположения обоснованы.

Первый цитокинин, выделенный из гидролизата ДНК и названный кинетином (6-фурфуриламинопурин), был открыт по его способности вызывать совместно с ИУК деление клеток в изолированной сердцевинной паренхиме табака. Последующие исследования показали, что кинетин способствует делению клеток и у других тканей, а также при действии на целое растение, например, при индукции пробуждения пазушных почек, образовании боковых корней, стимуляции

прорастания семян. Цитокинины были найдены в меристемах, в незрелых плодах, семенах и в камбии, в опухолевых тканях, т. e. там, где наблюдается интенсивное деление клеток. Более полный обзор литературы об участии цитокининов в делении клеток можно найти в работах Кулаевой и Миллера. Нас интересует вопрос о месте действия цитокининов в митотическом цикле и о характере их взаимодействия с ИУК.

При действии кинетина на сердцевинную паренхиму стебля табака началу деления клеток предшествовало увеличение количества ДНК. Это позволяет предположить, что действие цитокининов на деление осуществляется в периоде G₁.

Подтверждением может служить работа Мак Леода, в которой было показано, что кинетин увеличивает скорость синтеза ДНК у клеток, которые в момент обработки еще не вступили в S-период, и не влияет на нее у клеток, находящихся в момент обработки в S-периоде. Таким образом, чтобы изменить скорость синтеза ДНК, кинетин должен был подействовать на клетки до начала S-периода, т. е. в периоде G₁.

В настоящее время мы не знаем, можно ли с помощью чередования выращивания ткани на среде без кинетина с выращиванием на среде с кинетином получить синхронизацию деления клеток в этой ткани. Поэтому пока нельзя решить, является ли кинетин специфичным индуктором какого-то этапа митотического цикла или необходим на всем его протяжении.

Следует отметить, что потребность изолированных тканей в кинетине для размножения клеток не такая строгая, как в отношении ауксина. Существует много культур, полученных из нормальных тканей растений, которые длительное время выращиваются на средах без кинетина. Кроме того, в культурах тканей, нуждающихся в цитокининах, иногда возникают «мутантные» штаммы, которые приобретают способность обходиться без них во время размножения клеток.

Такой штамм возник и у нас из исходной культуры ткани табака, любезно предоставленной Р. Г. Бутенко. Исходная ткань была получена из сердцевинной паренхимы стебля табака обычным методом с помощью ИУК и кинетина, а в последующих пассажах выращивалась на средах с НУК и кинетином. Штамм, возникший в наших условиях, имел другую консистенцию и окраску по сравнению с исходной тканью и не нуждался в кинетине для размножения клеток. Вероятно, как и в случае с опухолевыми тканями, эта автономность в отношении цитокининов связана с приобретением тканью способности к самостоятельному их синтезу.

Сердцевинная паренхима стебля табака и других растений, а также каллусные ткани, полученные из них, являются ярким примером роли взаимодействия фитогормонов в регуляции деления и растяжения клеток. Известно, что деление клеток в этих тканях осуществляется лишь при наличии в среде ИУК и кинетина. Если в среде присутствует только ИУК, то происходит растяжение клеток, а деления почти не наблюдаются. Можно предположить, что ИУК и кинетин активируют разные участки митотического цикла и возможно даже разные участки периода G₁. Поэтому одного фитогормона недостаточно для замыкания митотического цикла.

Кинетин способен, по-видимому, оказывать влияние на деление не только растительных клеток, но и клеток животных, парамеций и тритона.

В отношении гиббереллина вначале сложилось мнение, что его стимулирующее действие на рост связано с увеличением длины клеток. Но в дальнейшем появилось большое число данных, показавших значительный эффект гиббереллина на размножение клеток.

В (большинстве работ стимулирующее действие гиббереллина на деление клеток отмечалось в верхушке стебля или, более локализованию, в субапикальнюй меристеме. Ню наблюдалось активирующее действие гиббереллина и на деление клеток камбия, ксилемной паренхимы, на деление клеток в культуре ткани.

В ряде работ показано, что гиббереллин лишь усиливает деление клеток, но не индуцирует его. Только при действии на субапикальную меристему розеточных растений и растений, обработанных ретардантами, действие гиббереллина может рассматриваться как индуцирующее. Приведенные данные позволяют предположить, что гиббереллин не является абсолютно необходимым фактором для осуществления деления клеток, а выступает скорее в роли агента, уменьшающего или снимающего тормозящее действие на деление других эндогенных или экзогенных факторов. Это подтверждается тем, что стимулирующее действие гиббереллина на деление клеток проявляется у тех растений, рост которых замедлен либо освещением, либо обработкой ретардантами.

В наших опытах с проростками низкорослого гороха сорта Алтайский мозговой было показано, что гиббереллин усиливает деление клеток в междоузлиях только зеленых, но не этиолированных проростков. При этом количество клеток в междоузлиях этиолированных проростков и в зеленых проростках, обработанных гиббереллином, было почти одинаковым, тогда как без гиббереллина на свету количество клеток в междоузлиях было значительно меньше, чем в темноте. Таким образом, подавление размножения клеток, вызванное светом, снималось гиббереллином.

Так как гиббереллин действует как фактор, стимулирующий деление клеток, а не как фактор, облигатно необходимый для этого, он не нашел широкого применения в культуре растительных тканей in vitro. Лишь в некоторых работах он включается в качестве одного из компонентов в состав питательных сред, большинство же исследователей выращивают изолированные ткани без гиббереллина.

Наиболее примечательная особенность действия гиббереллина на деление клеток целого растения состоит в том, что он не нарушает упорядоченности делений клеток в меристемах, не дезорганизует их, как наблюдается в случае применения ауксина и кинетина. Сакс и др. отмечают, что более 80% индуцированных гиббереллином митозов были ориентированы вдоль оси стебля. Поэтому стимулирующее действие гиббереллина на рост чаще всего выражается в вытягивании стебля, а не в его утолщении. В некоторых случаях гиббереллин даже повышал способность меристем противостоять дезорганизующему влиянию экзогенного ауксина. Возможно, это связано с усилением полярного транспорта ауксина в целом растении под влиянием гиббереллина.

Есть основания полагать, что в настоящее время известны не все гормональные факторы, управляющие в растении делением клеток. Так, накапливаются данные о том, что некоторые полиамины (путресцин, кадаверин, спермин) стимулируют деление клеток в культуре ткани топинамбура. Они найдены в кокосовом молоке. Считают даже, что путресцин и кадаверин можно отнести к физиологически активным веществам. Показано, что эти соединения стимулировали синтез ДНК в системе in vitro, если матрицей для синтеза служил нуклеогистон или хроматин из зародышей гороха, из печени и зобной железы крыс. Если же матрицей служила депротеинизированная ДНК, то эти диамины угнетали синтез ДНК. Таким образом, активность этих веществ показана не только на живых клетках, но и на реконструированных биохимических системах.

К неизвестным в настоящее время факторам деления клеток можно отнести и так называемый «фактор кондиционирования». Известно, что изолированные из культуры тканей одиночные клетки высших растений и животных при помещении их в свежую среду не делятся. Однако деление этих клеток можно вызвать, если поместить выделенную одиночную клетку рядом с активно пролиферирующей массой ткани, которая может служить тканью — «кормилицей», или поместить ее в так называемую «кондиционированную» среду, т. е. в среду, в которой уже происходил рост ткани. Было показано, что «фактор кондиционирования» необходим не только для клеток нормальных, но и опухолевых тканей, что он не является видоспецифичным. Наследование природы этого фактора показало, что и у растительных, и у животных тканей он является недиализуемым, высокомолекулярным веществом.

Вероятно, этот фактор образуется и одиночными клетками, но при большом объеме свежей среды он разбавляется до концентрации, недостаточной для деления клеток. Об этом свидетельствуют опыты Лескура, в которых попользовалась суспензия клеток явора (Acer pseudoplatanus). При концентрации суспензии после пересева на свежую среду 1800 клеток на 1 мл размножение клеток начиналось сразу же, при концентрации 1200 клеток на 1 мл — после некоторого лаг-периода, а при концентрации 600 клеток на 1 мл размножение клеток вообще не наступало. Однако, если добавлялась кондиционированная среда, то размножение клеток начиналось без лаг-периода даже при концентрации 600 клеток на 1 мл.

Рассмотрение факторов, управляющих размножением растительных клеток, показывает, что все известные и неидентифицированные в настоящее время вещества оказываются либо совершенно необходимыми для осуществления митотического цикла клеток, либо существенно изменяют скорость их размножения. Поэтому растение имеет широкий спектр возможностей для регулирования скорости размножения клеток в разных участках своего тела во время морфогенеза.