Разоружать можно только вооруженного врага. А таким до зубов вооруженным паразитом является некротроф, обладающий мощными орудиями агрессии в лице токсинов и экзоферментов.
Однако и биотрофы не лишены оружия нападения, хотя оно у них утонченно и усовершенствовано. Ведь этим паразитам все время приходится лавировать между опасностью погубить питающую их клетку хозяина и необходимостью прокормить самого себя. Итак, токсины…
Еще в начале нашего века предполагалось, что оксидазы растений, в частности пероксидаза, могут участвовать в разрушении токсинов микроорганизмов. Однако экспериментальные данные о способности растительных тканей детоксицировать токсины патогенов пока еще очень ограниченны. Известно, например, что устойчивые растения овса, райграса и сорго способны поглощать и детоксицировать виктории — токсин возбудителя гельминтоспориоза овса. Из тканей устойчивых растений токсин быстро исчезал, тогда как восприимчивые растения теряли тургор и выделяли викторин в окружающую среду. Механизм обезвреживания токсина пока не ясен.
Известен и другой способ растений избежать воздействия токсинов паразита — потерять к ним чувствительность, но это возможно только лишь но отношению к специализированным патотоксинам, имеющим в клетке определенную мишень действия. Что касается фито — и вивотоксинов, не обладающих избирательностью действия и одновременно нарушающих многие звенья обмена, то к ним вряд ли могут возникнуть нечувствительные формы. Вообще к ингибиторам, не имеющим определенной мишени, на которую они действуют, а неспецифически повреждающим многие «сайты», адаптация маловероятна. Возможно, поэтому к неспециализированным некротрофным паразитам, обладающим неспецифическими токсинами с широким спектром антибиотического действия, нет и не может быть устойчивых форм растений, а существуют только более или менее восприимчивые.
Примером устойчивости растений, основанной на его нечувствительности к токсину паразита, являются взаимоотношения сахарного тростника и возбудителя глазчатой пятнистости Helminthosporium sacchari. Гриб вызывает на листьях тростника своеобразные пятна в виде глаз, от которых распространяются красно-коричневые полосы. Поскольку возбудитель удается выделить только из пятен, считается, что сами гифы гриба находятся в местах пятен, а полосы — это результат воздействия его токсина. Токсин получил название гельминтоспорозида и представляет собой 2-оксициклопропил-D-галактопиранозид.
Было испытано 182 клона сахарного тростника и установлено, что устойчивые к паразиту клоны устойчивы и к его токсину. В чем дело? Может быть, в устойчивых растениях токсин разлагается, поскольку в них есть ферменты, способные его детоксицировать? Определения показали, что это не так. Меченый токсин вводили в растения как устойчивых, так и восприимчивых клопов тростника, а затем спустя некоторое время определяли его количество, оставшееся в растениях. Разницы не нашли.
Картина несколько прояснилась, когда удалось обнаружить, что токсин связывается с цитоплазматической мембраной хозяина, однако не у всех клонов растений. Только у восприимчивых. Значит, у восприимчивых растений в отличие от устойчивых на мембране есть некое вещество — рецептор, который связывает токсин. И такой рецептор удалось выделить. Для этого мембрану восприимчивого клона обработали детергентом, а потом расфракционировали выделенные белки. Рецептор оказался белковым тетрамером, т. е. состоял из 4 белковых субъединиц, с молекулярной массой 48 000. Токсин связывается с рецептором на восприимчивых сортах, в результате чего их клетки погибали.
Далее оказалось, что мембрана устойчивого клона тоже содержала такой же (правда, не точно такой же!) белок. Во всяком случае, белок из устойчивого клона выделялся тем же способом и имел ту же молекулярную массу.
Более того, белок-рецептор устойчивого и восприимчивого сортов не смогли различить даже антитела кролика, поскольку они связывались как с одним, так и с другим белком.
Оказалось, что различие между белками, которое не заметили даже антитела, заключается в 4 аминокислотах (лизине, серине, глицине, глютаминовой кислоте). Эти аминокислоты маскируют у устойчивого клона центры связывания белка с токсином, что и делает растение нечувствительным к нему. Кстати, если белок из устойчивого клона тростника обработать детергентом, в результате чего его маскировка нарушается, он приобретает свойство связываться с токсином паразита, и растение из устойчивого превращается в восприимчивое. Наоборот, если ткани восприимчивого клона тростника обработать антисывороткой, полученной на их белок-рецептор, то восприимчивый клон тростника превратится в устойчивый. Дело в том, что имеющиеся в антисыворотке антитела свяжутся с белком-рецептором и защитят его от действия токсина.
Таким образом, из проведенных опытов можно сделать вывод, что восприимчивость растения зависит от наличия специфического рецептора, тогда как устойчивость определяется его отсутствием. Устойчивость в этом случае можно рассматривать не как активную защитную реакцию, а как пассивный признак.
Теперь относительно защиты от системы экзоферментов паразита, в первую очередь пектолитических, которым, как уже говорилось, принадлежит ведущая роль в патогенезе растений.
Нужно сказать, что стратегия обороны растения от экзофермептов у некротрофов и биотрофов не может не быть различной. Для защиты от некротрофов, для которых быстрая гибель растительных клеток является залогом их успешного паразитирования, экзоферменты паразита должны быть как можно скорее инактивированы. Защита от биотрофов предполагает не столько инактивирование фермента, сколько его регулирование. Некоторая доля активности ферментов, в частности пектолитических, может быть даже полезна для растения. Так, К. В. Васильевой было показано, что пектолитические ферменты некоторых паразитов могут служить не только патогенными факторами, но и индукторами защитных реакций растения.
Регулирование действия пектолитических ферментов, как, впрочем, и некоторых других экзоферментов фитопатогенов, достигается с помощью нескольких механизмов. Это прежде всего регулирование на уровне образования молекул фермента либо за счет его подавления, либо, наоборот, индуцирования. Дело в том, что пектолитические ферменты у паразитов вырабатываются только в том случае, если в среде, где они растут, присутствует пектин, который и вызывает их образование. Это так называемое явление субстратной индукции. Таким образом, пектолитические ферменты индуцируются только веществами, которые им предстоит разлагать. Поэтому наличие либо отсутствие субстрата так же, как его состав, является средством регулирования синтеза этих ферментов.
Одним из способов регулирования ферментов является их катаболитная репрессия. Катаболитная репрессия — механизм экономного и целесообразного образования лишь тех ферментов, которые позволяют организму существовать с наименьшими энергетическими затратами. Предположим, у микроорганизма есть на выбор несколько источников питания. В таком случае он будет в первую очередь потреблять те вещества, использование которых ему наиболее выгодно. Например, в среду с пектином, где растет некий фитопатоген, добавляется глюкоза. Естественно, что паразит предпочтет глюкозу пектину, поскольку для использования пектина его нужно сначала разложить, а для этого образовывать ферменты, расщепляющие его пектиновые вещества, тогда как можно начать прямо с глюкозы, для превращения которой ферменты всегда имеются в наличии. Патоген начинает потреблять глюкозу вместо пектина, а пектолитические ферменты за ненадобностью перестает образовывать. Вот и получается, что добавление глюкозы (катаболита) к пектину подавляет (репрессирует) выделение паразитом пектолитических ферментов. Это и есть катаболитная репрессия.
Явление катаболитной репрессии удалось использовать для защиты от болезни платана. На места поражения наливали раствор сахара, в результате чего образование грибом экзоферментов, являющихся фактором его патогенности, прекращалось. Так сахаром удавалось вылечить болезнь.
Предохранить клеточные стенки растений от действия разрушающих ферментов возможно и с помощью их суберинизации и лигнификации. Суберин и лигнин, откладываясь в составе стенок, стабилизируют их и делают содержащиеся в них вещества недоступными для ферментов фитопатогенов.
И все-таки главным фактором защиты от экзоферментов фитопатогенов является их инактивирование с помощью различного рода ингибиторов. Важная роль в этом принадлежит фенольным соединениям, особенно продуктам их окисления, которые являются мощными факторами неспецифического ингибирования ферментов паразита.
Дело в том, что окисленные производные фенолов легко образуют комплексы с SH-, NH2— и NH-группами белков-ферментов, в результате чего последние теряют сдою активность.
Подобный механизм ингибирования может иметь значение и в защите растений от некротрофных патогенов, и в явлении сверхчувствительности, возникающей в ответ на проникновение несовместимых биотрофов. Например, катехины, присутствующие в клеточных стенках плодов винограда, подавляют активность пектолитических ферментов возбудителя серой гнили, причем чем больше их содержание, тем выше степень устойчивости. А продукты окисления хлорогеновой и кофейной кислот, содержащиеся в некротизирующихся в ответ на проникновение возбудителя фитофтороза тканях картофеля, подавляют пектиназы этого паразита.
Но если паразиты имеют ферменты, разрушающие клеточные стенки растения, то и растения в свою очередь тоже образуют ряд ферментов, повреждающих клеточные стенки паразитов: если стенки патогена состоят из хитина — хитиназы, если из глюкана — различного рода глюканазы и т. д. В ответ на это паразит образует ингибиторы, подавляющие действие этих ферментов. Получается, что взаимоотношения паразита и хозяина заключаются в непрерывном процессе взаимной индукции: субстрат (клеточная стенка паразита) индуцирует ее разрушающий фермент, а присутствие фермента индуцирует у паразита ингибитор, его подавляющий.
К. В. Васильевой было показано, что, для того чтобы подавить активность ферментов патогена, нужна значительно меньшая концентрация ингибиторов, чем для подавления роста самих патогенов. Например, в ксилемных сосудах вилтоустойчивых сортов хлопчатника присутствуют живые споры возбудителя болезни, однако сами симптомы болезни отсутствуют. По-видимому, присутствующие в сосудах ингибиторы подавляют экстрацеллюлярные (внеклеточные) ферменты паразита, не нарушая или почти не нарушая его жизнеспособности. Не подсказывает ли этим сама природа новый подход к использованию химических средств защиты растений, основанный на ингибировании не самих патогенов, а их патогенных факторов. Иными словами, не столько уничтожать паразита, сколько его разоружать, что вполне соответствует духу времени, в котором мы живем.
К. Т. Сухоруковым с сотрудниками была проведена серия опытов, свидетельствующих о способности растений образовывать белки-антиферменты. Так, в ответ на введение гидролитических ферментов паразитов в растениях образовывались антиферментные ингибиторы. Причем образовывались не просто ингибиторы, а ингибиторы специфические, т. е. подавляющие только тот фермент, который вводился в растение. Ведь до сих пор речь шла только о неспецифических низкомолекулярных ингибиторах ферментов, к которым относятся окисленные производные фенолов. Эти вещества инактивируют любой фермент, лишь бы в составе его белка (а все ферменты — белки) содержались сульфгидрильные и другие реакционноспособные группы.
Вопрос о наличии специфических ингибиторов ферментов в растениях до сих пор оставался открытым, и лишь в последние годы удалось получить некоторые доказательства их существования. Оказалось, например, что в клеточных стенках двудольных, но не однодольных растений присутствуют высокомолекулярные белки, ингибирующие эндополигалактуроназы паразитарных грибов. Более того, количество таких ингибиторов возрастало г. ответ на инфицирование.
В последнее время выяснилось, что у растений имеются высокоспецифические ингибиторы белковой природы, обладающие способностью подавлять протеолитические ферменты, т. е. ферменты, расщепляющие белки (протеиназы). Такие ингибиторы обнаружены в семенах растений семейства бобовых, злаковых, сложноцветных, а также в клубнях картофеля, топинамбура, корнях турнепса. Большинство ингибиторов представляют собой белки со сравнительно невысокой молекулярной массой от 8000 до 30 000 Дальтон.
Особенностью белковых ингибиторов является их устойчивость к денатурации и протеолитическому расщеплению. Ингибиторы образуют стойкие комплексы с протеиназами, в результате чего последние теряют активность. Наличие в клетках протеиназ позволяет разрушать, а следовательно, выводить из строя нужный фермент в нужный момент, что является одним из факторов их регулировки. Но и сами протеиназы также нуждаются в регуляции, которую и берут на себя их ингибиторы.
Однако большинство ингибиторов протеиназ, обнаруженных в растениях, проявляют специфичность к протеиназам животных и микроорганизмам, и только несколько ингибиторов растений могут подавлять собственные растительные протеиназы, да и то эти ингибиторы присутствуют лишь в небольших количествах. Отчасти из-за этого, а отчасти из-за того, что большинство ингибиторов протеиназ были обнаружены в семенах и хранящихся органах растений, считается, что эти ингибиторы выполняют защитные функции, препятствуя деятельности протеиназ патогенов.
Защитная роль ингибиторов протеиназ еще более подтвердилась, когда стало известно, что после нападения колорадского жука в тканях картофеля, удаленных на некоторое расстояние от места внедрения, быстро накапливались ингибиторы протеиназ. А затем стало очевидным, что ингибиторы протеиназ образуются не только в ответ на насекомых, а на любой тип нарушений, включая механические поранения. Эти нарушения высвобождают вещества, названные фактором, индуцирующим накопление протенназ.
Если лист томатов подвергнуть сильному механическому поранению, то в других листьях образуются два ингибитора протеиназ, которые составляют свыше 10% от всех растворимых белков. Накопление этих ингибиторов требует определенных условий освещенности и температуры 37° С. Ингибитор I с молекулярной массой 39 000 состоит из 4 идентичных субъединиц, ингибитор II с молекулярной массой 25 000 состоит из 2 идентичных субъединиц. Оба сильно ингибируют протеиназы — хемотрипсин и субтилизин и слабо — трипсин. Фактор, индуцирующий накопление ингибиторов протеиназ, освобождался в воду, если листья молодых томатов срезали бритвой, а срезанный конец помещали в сосуд с водой. Этот фактор, будучи введен в листья, вызывал накопление ингибитора протеиназ с линейной скоростью.
В качестве индуктора ингибитора испытывали индолилуксусную кислоту, кинетин, гиббереллин, абсцизовую кислоту и этилен — пи одно из них не оказывало такого действия, как фактор, индуцирующий ингибиторы протеиназ. Образовавшись в клетках, ингибитор откладывается в центральной вакуоли в виде белковых кристаллов. Там они могут сохраняться длительное время, не разрушаясь.
Большим числом исследователей доказано участие ингибиторов протеиназ в регулировании свертывания крови, процесса оплодотворения, секреции ферментов и гормонов. Их недостаток в организме может приводить к тяжелым заболеваниям. В частности, нарушение равновесия между протеолитическими ферментами и их ингибиторами является одной из причин злокачественных новообразований. Препараты ингибиторов протеиназ широко используются в качестве терапевтических средств при лечении эмфиземы легких, панкреатита, шока и других болезней.
Таким образом, наличие специфических высокомолекулярных ингибиторов ферментов, защищающих растения от фитопатогепов, сомнений не оставляет. Сомнительным остается другое, а именно способность растений в ответ на введение в них определенного фермента образовывать строго специфические антиферменты, подавляющие только этот и никакой другой фермент. Признать это все равно, что признать за растениями способность образовывать антитела в ответ на введение антигена.