Обзор имеющихся в настоящее время данных о последовательности расположения аминокислот в молекуле рибонуклеазы был сделан.
Были рассмотрены физические свойства этого фермента как в нативном состоянии, так и при денатурации. На этом фоне мы можем рассмотреть некоторые особенности ковалентной и нековалентной структуры рибонуклеазы в связи с проблемой ее каталитической активности.
Как мы уже видели, этот белок содержит два довольно длинных «хвоста»: один с N-конца, состоящий из 25 аминокислотных остатков, а другой — с С-конца, состоящий из 14 аминокислотных остатков. Обе эти части цепи изучали путем гидролиза протеолитическими ферментами. Ричардс впервые показал, что нативная рибонуклеаза при расщеплении бактериальным ферментом субтилизином быстро и специфически гидролизуется по связи ала-cep (остатки 20—21) в N-концевом «хвосте». Полученные в результате гидролиза производные, в которых 20 остатков «хвостовой» части еще были соединены с «сердцевиной» фермента за счет какого-то очень сильного нековалентного взаимодействия, можно выделить на ионообменных колонках. Было показано, что они обладают такой же активностью, как нерасщепленный белок. Эта активная расщепленная молекула рибонуклеазы содержала, кроме N-концевого остатка лизина, характерного для нативного фермента, новый N-концевой остаток серина.
Можно также отщепить часть С-концевых аминокислотных остатков цепи, не вызывая инактивации молекулы. Путем обработки карбоксипептидазой удалось отщепить С-концевой остаток валина вместе с фракцией остатков серина и аланина, расположенных непосредственно перед валином. При испытании таких образцов расщепленного белка не было получено данных, которые указывали бы на инактивацию фермента.
Места действия протеолитических ферментов, вызывавших подобные расщепления, не сопровождавшиеся инактивацией, можно точно отнести к определенным участкам линейной полипептидной цепи рибонуклеазы.
Были описаны также некоторые активные продукты, полученные в результате более глубокого расщепления. Однако точное расположение связей, по которым шло расщепление, к сожалению, в настоящее время не установлено. Например, Узиль, Стейн и Мур сообщили о том, что им удалось выделить активные производные рибонуклеазы, подвергнутой перевариванию трипсином в условиях, при которых происходит частичное развертывание молекулы белка, т. е. в слабых растворах мочевины. Калницкий и Роджерс описали опыты, в которых для расщепления применяли карбоксипептидазу. При этом расщепляющий фермент, очевидно, содержал другие протеазы неизвестного типа, которые вызывали сильное разрушение молекулы без существенной потери активности. По мере анализа результатов этих исследований появляется возможность выяснить, что же происходит в тех или иных частях полипептидной цепи, что позволит нам сделать более точные выводы о расположении и природе «активного центра» этого фермента.
Можно извлечь важные сведения также из опытов, поставленных с целью определить, каковы минимальные изменения в молекуле, приводящие к инактивации фермента. Особый интерес в этом отношении представляют два опыта. В первом опыте инактивация рибонуклеазы происходила при фотоокислении. Вейл и Сейблс показали, что если подвергнуть этот фермент действию света в присутствии метиленового синего, то он медленно теряет свою активность. Эта утрата активности (по крайней мере на ранних стадиях фотоокисления) происходит параллельно с исчезновением одного (или, быть может, двух) из 4 остатков гистидина, имеющихся в этом белке. Хотя точное расположение остатка (или остатков) гистидина не определено, следует отметить, что 2 гистидиновых остатка из 4 находятся среди 20 аминокислот, образующих С-конец цепи.
Другой метод, вызывающий инактивацию, который, в конце концов, быть может, позволит выяснить химическую основу активности рибонуклеазы, состоит в переваривании молекулы пепсином в строго контролируемых условиях. Если рибонуклеазу подвергнуть действию пепсина при значениях pH, близких к 1,8, то происходит чрезвычайно быстрый гидролиз, по-видимому, одной-единственной, особенно лабильной пептидной связи. Макромолекулярную часть реакционной смеси можно выделить на ионообменных колонках. Она совершенно лишена ферментативной активности. Кроме того, удается обнаружить лишь один фрагмент — тетрапептид асп-ала-сер-вал. Последовательность аминокислот в этом тетрапептиде показывает, что он оторвался от С-конца цепи путем расщепления пептидной связи, которая располагается в полипептидной цепи после остатка фенилаланина в положении 120. Обнаружить другие места расщепления в макромолекулярном неактивном производном не удалось, и как физические исследования, так и анализ концевых аминокислот позволили сделать заключение, что в данном случае произошел лишь гидролиз одной этой связи.
Поскольку более ранние исследования действия карбоксипептидазы установили, что три аминокислотных остатка, локализованные на С-концевом участке, не имеют существенного значения, результаты этих исследований с действием пепсина показывают, что остаток аспарагиновой кислоты в положении 121 играет какую-то особую роль в формировании центра каталитической активности или в его функции. Это положение будет обсуждаться дальше в связи со спектральными свойствами рибонуклеазы и ее активных и неактивных производных.
Хотя суммарный анализ результатов опытов по расщеплению рибонуклеазы показывает, что некоторые участки цепи аминокислотных остатков имеют для активности большее значение, чем другие, однако нельзя сделать вывод, что каталитическая активность этого фермента обеспечивается лишь определенным линейным расположением аминокислот. Как окисленная рибонуклеаза, так и рибонуклеаза, превращенная в простую открытую цепь путем восстановления дисульфидных мостиков, совершенно лишены активности. Весьма вероятно, что для активности важны один или большее число участков цепи, возможно, расположенных довольно далеко друг от друга, и что их взаимное расположение в пространстве фиксировано вследствие ограничений, налагаемых дисульфидными мостиками или связями нековалентной природы.
В этом отношении представляют интерес некоторые недавно проведенные эксперименты, в которых исследовалась связь между регулируемым постепенным восстановлением дисульфидных мостиков и активностью. Дисульфидные связи можно восстановить тиогликолевой кислотой и многими другими восстанавливающими веществами. Было обнаружено, что восстановление одного из четырех мостиков в молекуле рибонуклеазы происходит очень быстро в отсутствие мочевины, но в 8 М растворе мочевины, в котором трехмерная структура белка дезориентируется и «разрыхляется», легко расщепляются все четыре мостика. В процессе восстановления активность падает, причем создается впечатление, что один, а может быть, и два мостика не нужны для ферментативной активности. Так, если в среднем восстановлена одна S—S-связь, сохраняется 80—90% исходной активности, хотя нативный фермент присутствует лишь в виде следов. Даже при содержании в среднем четырех SH-групп на 1 моль белка (что эквивалентно разрыву двух S—S-связей) сохраняется значительно больше 50% активности. Недавно при помощи ионообменных колонок удалось выделить некоторые промежуточные продукты на ранних стадиях восстановления, и в настоящее время исследуется, какие из мостиков наиболее чувствительны к восстановительному расщеплению. Предварительные данные показывают, что после расщепления дисульфидного мостика, соединяющего между собой первый и шестой полуцистиновые остатки, сохраняется почти полная активность фермента.
Эти опыты по восстановлению и рассмотренные ранее исследования расщепления протеолитическими ферментами позволяют нам провести на бумаге хирургическую операцию над ферментом и изобразить в двух измерениях структуру белка, необходимую для обеспечения его ферментативной активности.
Показаны различные экспериментальные изменения нативной молекулы вместе с последствиями таких изменений, отражающимися на ферментативной активности. Для построения этой схемы использованы также некоторые данные, полученные при сравнительном изучении рибонуклеаз поджелудочной железы быка и барана. На основании этой схемы напрашивается вывод о том, что наличия «хвоста», расположенного на N-конце цепи, или большей его части, вместе с частью «сердцевины» молекулы достаточно для проявления каталитической активности. «Активный центр», безусловно, представляет собой сложную трехмерную структуру, однако в этот центр входит не вся молекула белка, а лишь часть ее. Построенная схема весьма гипотетична, и мы приводим ее здесь лишь для того, чтобы показать возможные направления развития будущих исследований биологической активности этого фермента.
Весьма возможно, что удаление и других частей структуры не вызовет снижения активности. Однако мы можем достаточно обоснованно сделать вывод, что либо значительная часть ковалентной структуры рибонуклеазы представляет собой ненужный рудимент, либо в функции и внутриклеточном поведении рибонуклеазы имеются такие стороны, о которых мы до сих пор ничего не знаем.
Прежде чем закончить рассмотрение связи между строением фермента и его функцией, коснемся некоторых особенностей нековалентных структур в связи с их каталитической активностью. Мы касались некоторых физических свойств рибонуклеазы в условиях необратимой денатурации мочевиной. Относительно большие изменения, происходящие в этих условиях в структуре фермента (например, внутренняя вязкость рибонуклеазы в 8 М растворе мочевины составляет 0,085, тогда как в разбавленном растворе соли она равна 0,036), заставили поставить вопрос о том, сохраняется ли активность в 8 М растворе мочевины. Против всяких ожиданий, было обнаружено, что гидролиз РНК в этих условиях не нарушился, а даже несколько усилился; отсюда сделали заключение, что активность фермента не зависит от наличия организованной трехмерной структуры. Однако впоследствии оказалось, что низкие концентрации фосфатных ионов или других поливалентных анионов (например, арсената) могут подавить развертывание спиралей, вызываемое мочевиной; таким образом, этот вывод следует считать преждевременным. Естественным субстратом для рибонуклеазы служит РНК, которая, будучи полианионом, может также в условиях опыта вызывать вторичное свертывание молекул фермента в спираль. Разные технические трудности связанные со спектральными и оптическими свойствами РНК, затрудняют прямую проверку этой гипотезы. Однако модельные вещества, такие, как полиметафосфат и уридин-3-фосфат, также могут вызывать вторичное свертывание молекулы, судя по измерениям спектра действия, вращения плоскости поляризации и внутренней вязкости. Такое вторичное свертывание оказалось неполным. На это указывает несколько более низкая величина вращения плоскости поляризации, полученная для фермента в 8 М растворе мочевины в присутствии этих веществ, по сравнению с соответствующей величиной для нативного фермента в воде, а также неполное восстановление вязкости. Однако спектральные различия совершенно исчезли.
Эти опыты продемонстрировали, что полное сохранение «нативности» не имеет важного значения, о чем свидетельствует частичная, но значимая необратимость изменений вращения плоскости поляризации и вязкости фермента под действием анионов. Вместе с тем было установлено, что часть трехмерной структуры, обусловливающая специфические спектральные свойства некоторых из 6 остатков тирозина, непременно должна иметь определенную конфигурацию.
Для подтверждения этой гипотезы были исследованы спектры действия различных активных и неактивных производных рибонуклеазы. Было показано, что все производные рибонуклеазы, которые обладают активностью, имеют нормальный «сдвинутый» спектр, тогда как у всех неактивных веществ спектральные свойства были такими же, как у остатков тирозина с неизмененными резонансными свойствами. На основании этих исследований мы можем сделать предварительный вывод, что наличие сдвинутого нативного спектра позволяет «диагностировать» каталитическую активность и что факторы, вызывающие изменения в спектре, инактивируют фермент.
Суммируя наши представления по этому вопросу, следует сказать, что по крайней мере одна связь в N-конце цепи и часть С-конца не имеют существенного значения для ферментативной активности и разрыв одной, а возможно, и двух S—S-связей не сопровождается потерей активности. Различные данные показывают, что часть структур (особенно остаток аспарагиновой кислоты в положении 121), расположенных вблизи С-концевого «хвоста», имеет чрезвычайно большое значение.
Наконец, выявляется отчетливая корреляция между сдвигом спектра, характеризующим нативный фермент, и активностью. В настоящее время имеются довольно убедительные данные в пользу того, что такие сдвинутые спектры определяются наличием водородных связей между карбоксильными группами в белке и гидроксильными группами остатков тирозина; поэтому можно предположить, что в этой связи участвует свободная карбоксильная группа остатка аспарагиновой кислоты в положении 121, которая служит одним из факторов, определяющих пространственную структуру активного центра фермента.
Важность рассмотрения ферментативной активности белка в связи с характером его пространственной конфигурации особенно четко выявляется при ознакомлении с данными о химии рибонуклеазы, полученными Ричардсом. Продолжая изучение обладающих ферментативной активностью производных рибонуклеазы, которые были получены при ограниченном переваривании субтилизином, он исследовал природу нековалентной связи или связей, которые присоединяют N-концевой пептидный «хвост» к макромолекулярной части белка. Эту связь можно разорвать, обработав производное рибонуклеазы трихлоруксусной кислотой; N-концевой фрагмент (пептид, содержащий 20 аминокислотных остатков) можно отделить диализом и очистить с помощью электрофореза. Как показал Ричардс, ни пептид, ни макромолекулярный компонент по отдельности неактивны, но если их смешать, то активность полностью восстанавливается.
Ричардс изучал также спектральные характеристики как отдельных фрагментов, так и их смеси с восстановленной активностью. Пептид, состоящий из 20 аминокислот, но не содержащий тирозина, конечно, не дает поглощения при 280 мц. Макромолекулярный же фрагмент, как и следовало ожидать, поглощает ультрафиолетовые лучи в указанной области, но при этом не происходит сдвига спектра, наблюдаемого при изучении нативного белка или фермента, переваренного субтилизином, до разделения этих двух фрагментов. Спектр крупного фрагмента очень сходен со спектром нативной рибонуклеазы в растворе мочевины или после обработки такими инактивирующими реактивами, как пепсин. Если два компонента смешать, то сдвинутый спектр тирозина вновь появляется почти полностью. Это показывает, что пептидный «хвост» играет важную роль в определении той части трехмерной структуры белка, которая ответственна за аномальное поглощение тирозина.
Опыт Ричардса представляет собой пример биологической активности относительно короткого пептидного фрагмента, которая сильно напоминает активность некоторых пептидных гормонов передней и задней доли гипофиза. Полное восстановление активности рибонуклеазы происходит при концентрации порядка 10-6 М, т. е. в пределах, вполне допустимых для активности гормона. На основе одних лишь этих опытов нельзя сделать вывод, что N-концевой фрагмент пептидной цепи составляет существенную часть активного центра. Вполне возможно, что он лишь определяет соответствующее свертывание в остальной части молекулы. Какова бы ни была роль этого короткого фрагмента, силы, связывающие его с основной частью молекулы рибонуклеазы, по-видимому, многообразны и весьма специфичны.
Фрагмент, изучавшийся Ричардсом, служит не только важной составной частью каталитического «центра» рибонуклеазы, но, кроме того, обладает, по-видимому, способностью стабилизировать остальную часть молекулы. Активный продукт, образующийся при действии субтилизина, стабилен в водном растворе, что свидетельствует о значительной силе связи между двумя компонентами комплекса. Однако в растворе мочевины, где эти компоненты диссоциируют так же как и в трихлоруксусной кислоте, происходит быстрая денатурация макромолекулярной фракции, и ее не удается реактивировать добавлением пептида, даже если удалить денатурирующий агент. Специфическая конфигурация, обладающая каталитической активностью, в продукте, образующемся под действием субтилизина, определяется, таким образом, определенными связями и аминокислотными остатками, имеющимися в макромолекулярной структуре этого продукта, стабилизированной пептидным «хвостовым» фрагментом.
Попытки свести отдельные наблюдения над химической основой активности рибонуклеазы в единое целое еще преждевременны. Однако благодаря успехам современной химии белка мы сможем сделать это в ближайшем будущем. Вырисовывающаяся в настоящее время картина строения рибонуклеазы, где некоторые пространственно разделенные части белка представляют собой строго необходимые компоненты активного центра, тогда как другие части (по крайней мере одна дисульфидная связь и один набор аминокислотных остатков в разных частях цепи) не являются таковыми, служит наглядным примером, демонстрирующим необходимость перейти от планиметрических представлений о белках к стереометрическим.