Данные, полученные при изучении биохимических эффектов мутаций, убедительно показывают, что отдельные гены контролируют биосинтез отдельных белков.
В ряде случаев удалось установить связь между отсутствием или изменением того или иного фермента и мутацией одного определенного гена. Изучение подобных биохимических нарушений не только у микроорганизмов (например, у нейроспоры или у Escherichia coli), но также у человека и других высших организмов привело к созданию концепции «один ген — один фермент».
Еще совсем недавно термин ген в этом контексте служил лишь для обозначения чисто абстрактной единицы наследственности. Ген представляли себе как квант генетической информации, который каким-то путем контролирует биосинтез какого-либо одного белка, или, выражаясь более осторожно, биосинтез какой-либо «функциональной единицы». Достигнутые за последнее время успехи в изучении биохимии хромосом и ДНК, а также в составлении карт «тонкой генетической структуры», которые мы обсуждали в связи с генетикой фагов, позволяют сейчас рассуждать о действии генов не в абстрактной форме, а в терминах химии. Исследования Бензера, Стрейсингера, Демереца и его сотрудников, а также Понтекорво и многих других показали, что, по всей вероятности, идею о линейно-расположенных «генах», разъединяемых при генетической рекомбинации, можно довести до молекулярного уровня. Как показывают результаты их работ, термин псевдоаллелизм пришлось изобрести лишь потому, что обнаружить чрезвычайно редкие рекомбинации в неблагоприятном биологическом материале очень затруднительно.
Если мы в основном примем концепцию «один ген — один фермент» и если мы согласимся с современными воззрениями на роль ДНК как основного вещества, определяющего наследственность, то возникает необходимость серьезно разобрать данные, свидетельствующие о том, что информация, определяющая детали строения белка, заключена в химической структуре молекулы ДНК. Очень соблазнительно также предположить, что точковая мутация представляет собой весьма локальное изменение в последовательности компонентов внутри поли нуклеотидной цепи или в ее пространственной конфигурации и что такое локальное изменение, вероятно, отражается на последовательности аминокислот и свертывании цепи соответствующего белка. Многие исследователи принимают эти допущения в качестве рабочей гипотезы, однако в настоящее время все это главным образом плоды фантазии при весьма скудном фактическом материале. Путь от структуры гена до белка может оказаться весьма долгим и извилистым, и мы не можем исключить такие осложняющие обстоятельства, как совместное влияние нескольких генов на синтез одного белка или же участие в биосинтезе цитоплазматических факторов, которые, возможно, способны изменить или даже инициировать некоторые его этапы.
Однако если эта гипотеза приблизительно верна, то мы должны были бы, как указал Горовиц, наблюдать мутации, вызывающие качественные, а также количественные изменения в ферментах и других белках. Например, следовало бы показать, что различные мутации в пределах данного участка генетического материала, определяющего синтез белка, могут привести к образованию «мутантных» форм биологически активного белка, у которых соответствующая функция будет выражена в различной степени. Мутации, вызывающие изменение в тех участках молекулы белка, которые важны для его функции, должны быть летальными, тогда как мутации, оказывающие влияние на менее существенные части молекулы, могут остаться незамеченными, или же, пользуясь генетической терминологией, относиться к типу «растекающихся».
Несмотря на то что известны сотни примеров связи между генами и белками, корреляцию между мутацией отдельного гена и химическими и физическими свойствами какой-либо гомогенной молекулы белка удалось продемонстрировать лишь в небольшом числе случаев. Многие из этих положительных корреляций были обнаружены при изучении белков высших организмов по той простой причине, что достаточно чистые образцы белков легче получить из эритроцитов, молока или плазмы, чем из микроорганизмов. Однако достигнутые в настоящее время: успехи в составлении генетических карт микроорганизмов сильно стимулируют исследования связи между генами и химией белка, и весьма возможно, что объектами, обеспечивающими дальнейшее развитие этой области, послужат именно белки микроорганизмов. Если бы, например, удалось идентифицировать и выделить в чистом виде белок, биосинтез которого контролируется тем участком генетического материала бактериофага Т4, карта которого с таким изяществом составлена Бензером, то, несомненно, удалось бы очень подробно исследовать вопрос о существовании корреляции между «цистроном» и белком. Такой детальный анализ белков человека невозможен, поскольку построение детальных генетических карт человека затруднено по ряду причин.
Во всех случаях, за исключением гемоглобина человека, различия между нормальным белком и белком, полученным от мутанта, затрагивали подвижность при электрофорезе, устойчивость к высокой температуре и серологические признаки. Заряд, устойчивость и серологические свойства белка представляют собой весьма четко выраженные признаки; поэтому можно считать, что белки, изученные по этим признакам, существуют в виде форм, различия между которыми определяются аллеломорфными генами. Следует, однако, помнить, что мелкие органические молекулы, тесно связанные с белком, могут изменить его заряд, а полисахариды и другие вещества-гаптены — вызвать изменения антигенных свойств. По этим причинам гемоглобин человека представляет собой особенно благоприятный объект, поскольку установлено, что различия в поведении при электрофорезе и в растворимости, наблюдаемые у мутантных форм, действительно связаны с изменениями в последовательности чередования аминокислот.
В 1949 г. Полинг, Итано, Сэнджер и Уэллс сделали важное наблюдение. Они установили, что гемоглобин больных серповидноклеточной анемией ведет себя необычно при электрофорезе и что у людей с серповидноклеточностью (бессимптомное состояние) можно обнаружить смесь аномальных серповидных и нормальных клеток. Подробное изучение родословных семей с серповидноклеточной анемией показало, что это часто смертельное заболевание наследуется по Менделю. Путем анализа генетических взаимоотношений между серповидноклеточной анемией и серповидноклеточностью Ниль установил, что образование аномального гемоглобина определяется одним мутантным геном. Генетически анемию можно охарактеризовать как гомозиготное состояние соответствующего гена сиклемии, тогда как серповидноклеточность наблюдается при гетерозиготном его состоянии.
Работы Полинга и Итано с сотрудниками, а также открытие Хейрлейном и Вебером наследственной метгемоглобинемии, связанной с аномальным глобиновым компонентом, стимулировали поиски других генетических изменений в синтезе гемоглобина. В настоящее время известно выше десятка аномальных гемоглобинов, которые можно различать благодаря их необычным физическим свойствам. Кроме того, известен ряд патологических состояний, при которых ненормальность гемоглобина обнаруживается путем гематологических исследований, но изменений в его физических свойствах не наблюдается. При этом в крови обнаруживаются либо очень мелкие эритроциты, либо какие-нибудь другие изменения морфологии эритроцитов. Подобные случаи торможения синтеза нормального гемоглобина объединяют под общим названием талассемии. Поскольку, согласно наблюдениям, локус, контролирующий эффект талассемии, не аллеломорфен гену нормального гемоглобина HbА, Аллисон предложил для локуса талассемии обозначение Th; нормальный: аллель этого локуса обозначают ThN, а аллель талассемии — ThT. Приведены клинические названия и генотипические обозначения для ряда аномалий, связанных с молекулой гемоглобина. Этот перечень взят из прекрасного обзора Итано, в котором читатель может найти более подробные данные. Для наших целей достаточно сказать, что, во-первых, синтез некоторых аномальных гемоглобинов (С, S и т. п.) контролируется рядом генов, которые, по-видимому, аллельны (возможно, это псевдоаллели), во-вторых, некоторые другие аномалии, включенные в группу талассемии, связаны с генетическими аномалиями, которые не отражаются на физических и химических свойствах молекулы гемоглобина и которые, по-видимому, связаны с иными генетическими локусами, а не с локусом HbА.
Теперь перейдем к имеющимся химическим данным. Различия в электрофоретической подвижности гемоглобина из нормальной крови и из крови людей с серповидноклеточной анемией, которые наблюдали Полинг, Итано и их сотрудники, можно связать с изменением в последовательности аминокислот, приводящим к увеличению или уменьшению числа заряженных групп боковых цепей. Вместе с тем, возможно, что эти различия в величине заряда лишь кажущиеся и зависят от способа свертывания полипептидных цепей белка; при этом в зависимости от изменений конфигурации заряженные группы выявляются или, наоборот, маскируются.
Непосредственная проверка правильности этих двух гипотез была-произведена Ингрэмом, который детально изучил последовательность аминокислот в молекуле при помощи чувствительного метода «дактилографии». Его исследования показали, что, по-видимому, как гемоглобин S, так и гемоглобин С отличаются от нормального гемоглобина лишь одним-единственным аминокислотным остатком. Измененный участок молекулы показан. Остаток глутаминовой кислоты, имеющийся в гемоглобине HbА, в гемоглобинах S и С заменен соответственно валином и лизином. Изменения величины заряда на 1 моль (плюс 2 для S и плюс 4 для С по сравнению с гемоглобином А) согласуются с теми, которых следовало ожидать на основании электрофоретического анализа; никаких данных об изменениях последовательности аминокислотных остатков в других частях молекулы белка получено не было. Таким образом, в этом случае возможна прямая проверка предположения, что мутация в специфическом генетическом локусе вызывает специфическое изменение в ковалентной структуре белка, связанного с этим локусом. И действительно, опыт Ингрэма представляет собой проверку «с пристрастием». Менделирующие гены HbA, Hbs и HbС контролируют не только весьма ограниченный участок структуры, но, по-видимому, также одну и ту же его особенность, а именно последовательность остатков в этом участке. Если последовательность нуклеотидов в полинуклеотидной цепи ДНК определяет последовательность остатков в полипептиде, то как же объяснить, что эти три расщепляющихся локуса влияют на один и тот же участок полипептида?
Результаты, полученные Ингрэмом, можно объяснить по аналогии с гипотезой, предложенной Уотсоном и Криком. Неизбежное попарное соединение гетероциклических оснований, которого требует эта гипотеза, как уже упоминалось ранее, выдвигалось для объяснения точного самоудвоения нитей ДНК. Специфическая последовательность оснований в комплементарных нитях двойной спирали рассматривалась как комплекс закодированной генетической информации, которая, по-видимому, служит главной матрицей для синтеза белка. Наиболее вероятным был признан код, основанный на «тройках», в котором различные наборы нуклеотидов (по три в каждом) соответствуют одной специфической аминокислоте. Используя эту идею, мы можем перевести различную последовательность аминокислот у трех разных форм гемоглобина в соответствующий нуклеотидный код. Замена лишь одного нуклеотида другим в критической «тройке» нуклеотидов создает необходимое изменение в закодированной в этой тройке информации. Читатель вряд ли примет всерьез все эти рассуждения. Однако не следует забывать, что самые невероятные научные гипотезы иногда оказывались верными, и эта гипотеза, во всяком случае, заслуживает некоторого внимания из-за своей новизны и последовательности.
Существование трех форм гемоглобина, различие между которыми определяется одним «локусом», поставило очень интересный вопрос: почему случайная мутация трижды возникла в одном и том же месте, тогда как в мономере гемоглобина имеется примерно 300 аминокислотных остатков?
Это явление качественно напоминает результаты, полученные Бензером при изучении мутаций в участке rII бактериофага Т4. Бензер наблюдал, что среди многих сотен отобранных мутантных колоний непропорционально большое число было связано с мутацией одного и того же локуса, тогда как другие локусы мутировали очень редко. Неслучайное распределение мутирующих локусов, как у генетически хорошо изученных бактериофагов, так и в случае гемоглобина человека, о котором, к сожалению, мы знаем очень мало, позволяет предполагать, что лишь некоторые мутации «допустимы» и что в большей части генетического материала степень допустимости очень мала. Однако в равной мере можно предположить, что какие-то неизвестные особенности в строении ДНК больше благоприятствуют изменениям одних участков в последовательности нуклеотидов, чем других.
Весьма вероятно, что мутантные гены гемоглобина сохранились благодаря тому, что они связаны с каким-либо благоприятным влиянием (например, серповидноклеточная анемия связана с пониженной восприимчивостью к малярии).
Поскольку никаких других химических данных, подобных данным по гемоглобину человека, у нас нет, мы считаем целесообразным провести несколько более подробный анализ ряда ведущихся в настоящее время исследований, которые, быть может, позволят разрешить некоторые из поставленных здесь вопросов. Многие ученые в настоящее время ведут интенсивные исследования, пытаясь выделить и охарактеризовать определенные белки из организмов, генотипы которых различаются лишь по одному гену. Мы уже упоминали об изученных Горовицем и Флинтом тирозиназах мутантов нейроспоры, различающихся по устойчивости к высокой температуре и по энергии активации процесса их тепловой инактивации. Возможно, что после тщательной очистки этих тирозиназ и детального изучения их химического строения в этом случае, так же как и для гемоглобинов, удастся показать прямую связь химических изменений с мутацией. Изучение других белковых систем также обещает дать интересные сведения, особенно в тех случаях, когда белок легко выделить (как, например, β-лактоглобулины молока). Однако наибольшее внимание приковано к бактериям и бактериофагам, поскольку они дают возможность провести тонкий генетический анализ. По крайней мере три лаборатории работают над проблемой выяснения влияния мутаций в участке h фага Т2 на химическую природу фаговой частицы.
Участок h генетического материала фага Т2 определяет специфическую реакцию по отношению к бактерии-хозяину, а именно способность частицы фага адсорбироваться стенкой определенной бактериальной клетки. Так, фаг дикого типа T2h+ способен адсорбироваться на клетках Escherichia coli штамма В и заражать их, но не адсорбируется на клетках штамма В/2, а мутанты h способны заражать оба штамма (В и В/2). Таким образом, частицы дикого типа (h+) при выращивании на агаре, на поверхность которого равномерно нанесена смесь из бактерий Е. coli штаммов В и В/2, лизируют только клетки штамма В с образованием мутного стерильного пятна. Что же касается мутантов h, то они заражают клетки обоих штаммов, В и В/2, с образованием совершенно прозрачных стерильных пятен. (В дальнейшем удобно представлять себе мутацию h+ как «дефект» в «нормальном» участке h генетической нити.) Подобное различие в фенотипическом поведении можно использовать для подсчета числа частиц h и h+. Этот прием был использован Стрейсингером и Франклином для локализации различных мутаций h на линейной генетической карте, подобно тому как Бензер наносил на карту мутации r бактериофага Т4.
Поскольку методика нанесения на карту тонких генетических структур фага будет применяться все шире и шире, полезно еще раз кратко рассмотреть этот метод в общем виде на примере составления карты для участка h.
Фаг типа h, обозначаемый h00, наносили на чашку Петри, содержащую смесь клеток Е. coli штаммов В и В/2. Мутные пятна отбирали как пример обратных мутаций к генотипу h+. Таким образом был получен ряд мутантов типа h+. Затем 14 мутантов h+ с низким «индексом реверсии» скрещивали друг с другом, а также с исходным штаммом h+ путем смешанного заражения ими Е. coli.
У всех мутантов h+ была изучена способность давать спонтанный возврат к фенотипу h. Мутанты, имеющие высокий «индекс реверсии», не изучались, поскольку такие мутанты создали бы технические трудности при исследовании способности двух мутантов h+ давать фенотипы h в результате генетической рекомбинации.
Потомство фагов изучали (по характеру стерильных пятен) и подсчитывали процент фенотипов h, возникших в результате рекомбинации. Было обнаружено, что каждая пара рекомбинантов h+ дает рекомбинантов h с определенной воспроизводимой частотой. Однако во всех случаях эта частота была низкой (менее 1 %), свидетельствуя о том, что все изученные мутации h+ возникли на участке генетической карты протяженностью менее двух единиц рекомбинации (общая «длина» генетического материала у фага Т2, возможно, равна 800 таких единиц).
После того как было установлено, что все различные мутации h+ произошли в пределах короткого участка карты, возникла необходимость определить порядок их расположения по отношению друг к другу. Это было сделано при помощи скрещиваний фагов, различающихся по трем факторам; этот прием станет ясным, если его изобразить в виде простой схемы. Скрещивания производили путем смешанного заражения бактерий штамма В фагами, содержащими, помимо одного из локусов h+, еще либо локус r+, либо мутантный локус r22 (который принадлежит к числу локусов, влияющих на тип пятна, и нанесен на карту Бензером). Методика получения таких мутантов, меченных по двум факторам, очень сложна (она связана, в частности, с многократными возвратными скрещиваниями и отбором), и мы не станем ее описывать подробно. Достаточно указать, что были получены штаммы бактериофагов, которые позволили произвести скрещивания; локус r22 расположен на расстоянии 22 единиц рекомбинации от участка А, что было определено в скрещиваниях с участием двух факторов.
Относительное расположение двух локусов h+ по отношению к локусу r22 можно определить, учитывая частоту форм А, возникших путем рекомбинации и несущих признак r+. Все эти рассуждения требуют, конечно, ряда допущений, о которых мы упоминали ранее, в том числе линейного расположения генетических локусов у фагов и наличия механизма перекреста, хотя бы аналогичного механизму, обеспечивающему рекомбинации у высших организмов. Эти допущения, по-видимому, в данном случае применимы. Порядок расположения локусов h+ на карте, который был определен на основании данных скрещиваний фагов, различающихся по трем факторам, соответствует расстояниям между локусами, определенным на основе предварительных данных, которые были получены в опытах по скрещиванию фагов, различающихся по двум факторам.
Прежде чем рассмотреть эти данные с точки зрения генетического контроля химического состава у фагов, необходимо обратить внимание на одно наблюдение, касающееся выяснения функционального единства участка А. Принадлежат ли все мутации А+, показанные на карте, к одной функциональной единице (к одному цистрону), или же они, быть может, принадлежат к разным группам, которые, действуя совместно, определяют специфическую реакцию по отношению к хозяину? Это можно решить, применив цис-транс-тест, описанный ранее для мутаций г. Стрейсингер показал, что все мутации А принадлежат к одной функциональной единице; это было сделано путем сравнения частоты появления фагов фенотипа h (т. е. адсорбирующихся на бактериях как штамма В, так и штамма В/2) при скрещиваниях цис-(АхА+) и транс-(h+1 х h+2) — типов. Если каждый из участков генетической нити действует самостоятельно и они вместе обусловливают нормальный фенотип h, то все потомки при подобной смешанной инфекции должны иметь фенотип h. Однако оказалось, что фенотипом h обладала лишь незначительная часть потомства (около 3%), что соответствует частоте, ожидаемой на основе перекреста и других последствий рекомбинации.
В случае цис-конфигурации наблюдался высокий процент частиц с фенотипом h (около 60%).
Таким образом, можно сделать вывод, что лишь функционально «полноценный» участок h может обеспечить проявление признака h.
Теперь мы можем рассмотреть, какое влияние оказывает участок h генетической карты на фаговую частицу. Мы должны, конечно, сосредоточить свое внимание на тех химических и морфологических признаках фага Т2, которые имеют отношение к его прикреплению к бактериальной клетке. Частицы фага прикрепляются к бактериальной клетке концами своих отростков. Так же прикрепляются и «тени» фагов, которые можно получить, если внезапно подвергнуть интактные частицы фага осмотическому шоку. Поскольку «тень» фага состоит почти из одного белка (если не считать следов углеводов, которые присутствуют в таких малых количествах, что их функциональное значение маловероятно), можно заключить, что процесс прикрепления обусловлен каким-то специфическим белковым компонентом. Предположение о белковой природе вещества, обеспечивающего адсорбцию, подтверждается также наблюдениями, показавшими, что процесс утраты способности фага к адсорбции под влиянием таких веществ, как мочевина, по своей кинетике очень сходен с процессом денатурации белков. Установлено также, что при блокировании аминогрупп фагов они утрачивают способность прикрепляться к бактериям.
Можно подойти к проблеме выделения и описания белкового компонента, ответственного за специфическую реакцию на бактерий-хозяев, двумя путями. Первый путь состоит в выделении отдельных фрагментов из разрушенных фаговых частиц. Такие исследования проводили Бреннер и его сотрудники в Кавендишской лаборатории Кембриджского университета. Эти исследователи пришли к выводу, что специфичность к бактерии-хозяину определяется тонкими нитями, которые прикреплены к отростку вирусной частицы и обволакивают бактериальную клетку; они получили высокоочищенные концентраты одних этих нитей для химического анализа.
Второй путь связан с фракционированием всей смеси белков, входящих в состав «теней» фагов, причем для этого применяют те же методы, что и для выделения фермента из неочищенного экстракта тканей. «Тени» фагов можно растворить различными способами, не вызывающими изменений ковалентной структуры входящих в их состав белков. При использовании для растворения таких веществ, как мочевина и гуанидин, растворы, по-видимому, можно изучать методами хроматографии, электрофореза и ультрацентрифугирования.
Как при морфологическом, так и при химическом подходе к проблеме фракционирования необходимо производить пробу на функциональную активность. Такая проба, хотя и косвенная, была разработана. Она основана на том, что антигенные свойства Т-четных фагов, обнаруживаемые по их реакции с кроличьей антифаговой сывороткой, контролируются тем же генетическим локусом, который определяет специфичность по отношению к бактерии-хозяину. Стрейсингер показал, что между локусами, определяющими специфичность к хозяину и серотип рекомбинаций уловить не удается.
Таким образом, можно испытать любую белковую или морфологическую фракцию, определив ее способность блокировать, нейтрализующую фагов активность препарата, содержащего инактивирующие антитела.
Исследование химических изменений, вызываемых мутациями в участке А фагов, только начато. Сначала необходимо разрешить проблему выделения белка. Однако можно надеяться, что эти работы, так же как и другие исследования, касающиеся иных участков генетической карты фага, дадут нам в конечном счете возможность непосредственно сопоставить генетические изменения со структурными модификациями в молекулах белка. Преимущество использования для таких исследований фагов и других микроорганизмов состоит в том, что для этих «организмов» можно составить очень точные генетические карты.
Например, Левинталь и Герен из Массачусетского технологического института недавно начали работу по нанесению на карту цистрона, контролирующего синтез щелочной фосфатазы у Е. Coli. Этот фермент синтезируется в больших количествах, если ограничить содержание фосфатов в культуральной среде. Микроорганизмы выращивают на чашках, содержащих среду с низким содержанием фосфатов. Затем эти чашки опрыскивают нитрофенил-фосфатом. Клетки, содержащие щелочную фосфатазу, расщепляют фосфатный эфир, и при этом выделяется желтый нитрофенол. При этом колонии бактерий, содержащих фермент, желтеют, некоторые мутанты остаются белыми, а другие мутанты, содержащие фермент средней активности, приобретают слабую окраску. Из разных штаммов можно выделить активные или неактивные ферменты. В настоящее время проводят анализ их структуры.
Если расчеты Бензера, выражающего длину рекона в отдельных нуклеотидах, входящих в состав цепи ДНК, верны, то можно надеяться, что удастся генетически разделить локусы, расположенные так близко друг к другу, что контролирующие структуру гемоглобинов, исследованных Ингрэмом. Например, в участке h расстояние между локусами h+37 и h+0 составляет, по-видимому, лишь 0,004 единицы рекомбинации. Если выразить это, следуя Бензеру, в нуклеотидах, то получится величина, соответствующая одной паре нуклеотидов. Во всех этих рассуждениях генетическая сторона недостаточно обоснована, а между тем химик всегда стремится к максимальной достоверности. Поэтому биохимики охотно готовы затратить время и силы на проверку правильности общей гипотезы. В случае успеха это даст возможность начать разрешение некоторых из наиболее важных проблем биологии.