В замечательных исследованиях Мевуса и Куна подвергались изучению возникновение половых различий и копуляция гамет одноклеточных водорослей рода Chlamydomonas.
Среди нескольких видов этого рода имеются как изогамные формы, у которых происходит копуляция гамет, одинаковых по размерам и внешнему виду, так и виды, дающие легко различимые гаметы разного пола. Вид Chlamydomonas eugametus, как показывает само название, является нзогамным. Жизненный цикл этого организма таков.
При культуре на агаризированном питательном растворе Кнопа вырастают неподвижные, лишенные жгутиков клетки, размножающиеся делением. Если их перенести в дистиллированную воду и выращивать на свету, тс они приобретают жгутики и становятся подвижными. Клетки, ставшие подвижными, сексуализируются, и у них возникает способность к копуляции. Так как клетки Chlamydomonas eugametus изогамны, то пол гамет можно узнать лишь по скрещиванию их с мужскими или женскими гаметами гетерогамного вида Chlamydomonas braunii; у этого последнего вида гаметы разного пола сильно различаются своими размерами.
Прохождение описанного жизненного цикла легко расчленить на ряд этапов развития, если использовать для этого действие света. Так, например, если культивировавшиеся в темноте на агаризированном питательном растворе клетки перенести в дистиллированную воду и подвергнуть трехминутному освещению, то они приобретут жгутики. Но эти жгутики сначала неподвижны, и для того, чтобы они стали подвижными, надо подвергнуть их дополнительному двухминутному освещению. Ставшие подвижными клетки еще не сексуализированы и не обладают способностью к копуляции. Нужно действие коротковолновых световых лучей около 4500 А на протяжении 10—12 мин., чтобы прошел процесс сексуализации женских гамет. Если облучение длится 15—20 мин., то происходит сексуализация мужских гамет.
Такова зависимость развития водоросли Chlamydomonas eugametus от освещения. Коротко эту зависимость можно формулировать так: под действием освещения в неподвижных, лишенных жгутиков клетках возникает ряд последовательных изменений, заканчивающихся сексуализацией и копуляцией гамет. Сопоставление наблюдений за изменением клеток водорослей и продолжительностью освещения дает основание предположить, что в основе детерминации соответствующих этапов развития лежат фотохимические реакции. Так как имеется соответствие последовательного прохождения отдельных этапов процесса развития и длительности освещения, то рождается мысль о последовательности обусловливающих этот процесс фотохимических реакций. Эта мысль нашла блестящее подтверждение в работах Мевуса и Куна. Основанием для поисков именно в этом направлении послужило очень интересное наблюдение Мевуса; он установил, что действие освещения на прохождение цикла развития может быть заменено прибавлением фильтратов культур, подвергавшихся освещению, к темновым культурам.
Так, например, фильтрат культуры Chlamydomonas, получившей нужное освещение для приобретения подвижности, может быть прибавлен к неподвижным клеткам темновой культуры, и он вызовет у них подвижность. Фильтрат культуры, клетки которой приобрели женскую сексуализацию, при действии неподвижные, но еще не сексуализированные клетки, вызывает у них женскую сексуализацию. Сексуализирующее воздействие оказывает на клетки водорослей и фильтрат мужских гамет, вызывая мужскую сексуализацию.
Во всех описанных случаях культуры получались путём тщательного фильтрования через фильтры Шамберлена, что исключало попадание в них клеток водорослей. Следовательно, активным началом фильтратов могли быть только какие-то вещества, экзосмировавшие из клеток водорослей. Так как эти вещества являются продуктами фотохимических превращений, то; можно было попытаться найти соединение, способное к ряду последовательных световых реакций. Введение продуктов этих реакций в растворы, где развивались клетки, должно было действовать на них так же, как освещение различной длительности, или как фильтраты культур клеток разных этапов развития.
Счастливое случайное наблюдение, подсказало, предположение, что эти активные в детерминации развития клеток водорослей вещества, — каротиноиды. В дальнейшем оставалась остановить выбор на одном из тех многочисленных производных этой группы веществ, которые встречаются в клетках водорослей. В итоге многочисленных опытов, в которых была использована богатейшая коллекция каротиноидов, имевшаяся в лаборатории Куна, была установлена следующая схема превращений.
В качестве исходного вещества для всего ряда указанных ниже реакций надо допустить существование соединения, еще не выделенного из растений — протокроцина. Этот каротиноид, распадаясь, дает начало двум веществам — пикрокроцину и кроцину. При этом одна молекула протокроцина образует одну молекулу кроцина и две молекулы пикрокроцина. Специальными опытами было установлено, что и кроцин и пикрокроцин являются специфическими физиологически деятельными веществами чрезвычайно высокой активности.
Кроцин — это вещество, действие которого на неподвижные клетки Chlamydomonas обусловливает возникновение их подвижности. Это производное протокроцина обладает столь большой активностью, что оно действует при разведении 1 : 1014. Расчет числа клеток, находившихся в объемах опытных сосудов, и числа молекул кроцина в тех же объемах при указанном разведении приводит к заключению, что кроцин действует, если на клетку приходится всего одна или несколько его молекул.
Химически кроцин представляет собой среднюю часть молекулы каротина, связывающую две конечных иононных группировки. С конечными углеродными атомами этой цепочки эфирной связью связаны две молекулы гентибиюзы. Пикрокроцин является остатком молекулы протокроцина после выделения из нее средней части в виде кроцина. Молекула пикрокроцина — это иононные группировки и связанные с ними эфирной связью остатки глюкозы.
Пикрокроцин — также вещество, обладающее высокой физиологической активностью, действующее при разведении до 1 : 108. Это соединение вызывает женскую сексуализацию подвижных клеток Chlamydomonas eugametus. Оно действует на клетки уже при значительно большем числе молекул, чем кроцин, а именно нижний предел эффективности пикрокроцина — 106 молекул на одну клетку. Поэтому в процессе прохождения этапов развития возникает естественная последовательность. Первые же подвергшиеся распаду молекулы протокроцина дают начало кроцину и пикрокроцину. Но, так как нижний порог эффективной концентрации кроцина в 106 раз меньше, Нем пикрокроцина, то сначала происходит приобретение подвижности клетками. В дальнейшем по мере накопления в культуре подвижных клеток в среде повышается концентрация пикрокроцина и, когда будет достигнуто разделение 1: 108, начнется сексуализация женских гамет.
Но оба вещества, и кроцин и пикрокроцин, не являются устойчивыми продуктами обмена веществ Chlamydomonas eugametus. Под действием ферментов клеток они подвергаются дальнейшим превращениям. От молекулы пикрокроцина отщепляется молекула глюкозы, и из каждой молекулы пикрокроцина получается одна молекула сзфранала. Сафранал — это также высокоактивное Вещество, действующее вплоть до разведения 1:1011. Оно вызывает мужскую сексуализацию подвижных клеток.
Активность сафранала примерно в тысячу раз выше активности пикрокроцина, вызывающего женскую сексуализацию подвижных клеток. Поэтому наряду с образованием женских гамет, по мере того как образовавшийся пикрокроцин будет давать начало сафраналу, под действием последнего появятся и мужские гаметы. Дальше, очевидно, должна начаться копуляция гамет, но процессу оплодотворения должно предшествовать возникновение готовности к этому процессу. Прохождение этого этапа развития обеспечивается образованием веществ оплодотворения.
Роль веществ оплодотворения играют два изомера кроцетина — вещества, возникающего одновременно с сафраналом. Кроцин подвергается под действием соответствующих ферментов переэтерификации, причем из молекулы кроцина образуется диметиловый эфир кроцетина. Это вещество является сложным эфиром дикарбоновой непредельной кислоты, и поэтому для него имеет место цис-транс-изомерия. Смесь цис- и транс-изомеров кроцетина. обладает очень высокой активностью, проявляющейся даже при столь ничтожных разведениях, как 1 : 1010.
Чрезвычайно интересным оказывается, что смесь изомеров, богатая, цис-изомером, действует на женские гаметы; при преобладании транс-изомера смесь становится действующей на мужские гаметы.
Схема иллюстрирует чрезвычайно интересную зависимость процессов развития от процессов последовательных превращений физиологически активных веществ. Анализ этой зависимости позволяет сделать ряд выводов большого принципиального значения. В дальнейшем изложении вопросов физиологии развития высших растений мы сможем сделать эти выводы основой для понимания многих важных фактов.
Рассматривая прохождение процесса ориентировки оси полярности развивающегося организма, мы прибегали к пользованию понятием детерминации. В частном случае процесса поляризации оплодотворенной яйцеклетки детерминация — это возникновение определенным образом ориентированного градиента концентрации фитогормона роста. Но можно ли свести сущность процессов детерминации при прохождении отдельных этапов развития только к перемещению уже имеющихся в организме физиологически активных веществ?
На этот вопрос приходится со всей определенностью дать отрицательный ответ. Для ряда этапов развития есть основание сделать заключение об образовании в процессе детерминации веществ, обусловливающих прохождение соответствующих этапов развития. Таким образом, можно в качестве положения достаточно широкого значения высказать утверждение, что при детерминации происходит образование и накопление специфических, активных в развитии растений веществ. Эти вещества, подобно гормонам роста и другим гормональным веществам, обладают высокой активностью и способны действовать в очень низких концентрациях. Но все же и для этих веществ существует порог эффективной концентрации.
Поэтому мы можем принять, что процесс детерминации — это накопление активного вещества данного рода до соответствующей концентрации, в которой оно уже эффективно. Приобретение готовности к прохождению данного этапа развития — это достижение веществом, накапливающимся в процессе детерминации, нижнего предела эффективности. Стоит взглянуть на приведенную схему превращения каротиноидов в клетках Chlamydomonas eugametus, чтобы получить иллюстрацию развитых выше представлений о сущности детерминации и приобретения готовности к прохождению данного этапа развития.
В биологии нет другого примера, относящегося к области физиологии развития, где бы с такой исчерпывающей полнотой и ясностью удалось установить зависимость развития от накопления точно идентифицированных соединений. Но особенный интерес данных Мевуса и Куна заключается в том, что им удалось эту зависимость проследить не для одного этапа развития, а для нескольких последовательно протекающих этапов.
Смотря на схему превращений каротиноидов, обусловливающих приобретение подвижности, сексуализацию и копуляцию клеток Chlamydomonas eugametus, мы легко приходим к очень важному выводу. В основе последовательности этапов развития лежит последовательность ряда химических реакций. Наиболее поразительным надо считать тот факт, что при превращении исходного вещества — протокроцина — каждый из продуктов реакции оказывается физиологически активным веществом.
Исследования Мевуса и Куна, несмотря на их исключительный успех, оставили неясным вопрос о механизме действия отдельных каротиноидов на прохождение соответствующих этапов развития. Но имеющийся в их работах экспериментальный материал позволяет заключить об общем характере действия каротиноидов как веществ подвижности, сексуализации и оплодотворения. Яснее всего это заключение, по отношению к кроцину — веществу, одна молекула которого, действуя на клетку, вызывает в ней изменения, придающие ей подвижность. Очевидно, что одна молекула кроцина может вызвать столь большие изменения в клетке, состоящей из миллиардов белковых молекул, лишь при условии возникновения цепных реакций. Только таким образом могут быть поняты факты поражающе высокой активности кроцина и близких к нему каротиноидов.
Выше, при объяснении механизма действия ростовых веществ, нам пришлось закончить рассмотрение этого вопроса указанием на цепной характер вызываемых ими реакций. Сейчас при ознакомлении с действием веществ, регулирующих сексуализацию и оплодотворенность клеток Chlamydomonas eugametus, мы приходим к такому же выводу. Есть достаточно оснований считать, что при действии гормонов роста и иных фитогормонов и регуляторов развития на организм всегда возникают цепные реакции. Так как при цепных реакциях количество молекул, принимающих участие в превращениях, лавинообразно нарастает, то становится понятной поражающе высокая активность регуляторов развития.
В дальнейшем изложении нам придется иметь дело с анализом экспериментальных данных, относящихся к изучению прохождения различных этапов развития высших растений. Ни в одном случае мы не будем располагать столь полными и законченными сведениями о прохождении процесса детерминации, о приобретении готовности к развитию, как это имеет место для Chlamydomonas. Поэтому мы считаем возможным, несколько предваряя выводы из описываемых ниже опытов, на основе уже изложенного материала дать общую схему прохождения этапа развития.
Таким образом, нам приходится в настоящее время составить себе довольно сложное представление о содержании изменений при переходе от одного этапа развития к следующему. Несомненно, что представления о стадийности развития, сформулированные Т. Д. Лысенко (1932) в его гипотезе развития однолетнего семенного растения, сыграли полезную роль. Они способствовали внедрению мысли о расчленимости развития, но понятие «стадия развития» оказалось в дальнейшем недостаточным.
Как известно, Лысенко предложил называть скрытые, но определяющие дальнейшие изменения формообразования процессы,— стадиями. Сами же отрезки жизненного цикла, проходимые на основе стадийных изменений, — фазами развития. Это разграничение, сводящееся в сущности лишь к тому, что устанавливается различие между скрытым начальным периодом прохождения этапа развития и наблюдаемыми затем изменениями формообразования, оказывается недостаточным.
Лишь в немногих случаях физиологический анализ процессов развития может быть проведен столь глубоко, что можно охарактеризовать все пять указанных изменений. Однако это более сложное представление о прохождении отдельных этапов развития имеет большое значение для понимания чрезвычайно сложной зависимости развивающегося организма от внешних условий. Только с этим более сложным представлением о развитии совместимы результаты ряда опытов по изучению действия температуры и освещения на развитие высших растений.