Серологические методы служат для высокоспецифичного прямого обнаружения вирусных частиц и поэтому особенно ценны при диагностике.
Простые способы, не требующие высоких затрат на оборудование, позволяют исследовать большие серии образцов. Однако в настоящее время антисыворотки получены еще не ко всем вирусам. При наличии ограничивающих факторов, которыми являются низкие концентрации определенных вирусов в растениях-хозяевах или вещества, мешающие серологической реакции, приходится применять высокочувствительные методики. Последние требуют больших затрат времени и средств на оборудование, в связи с чем далеко не всегда пригодны для диагностики в учреждениях практической защиты растений. Поэтому в дальнейшем сложные методики упоминаются лишь кратко, если их применение в серийной диагностике при определенных условиях перспективно (например, иммуноферментный анализ, или ИФА).
Перед описанием отдельных серологических методов дано краткое введение в основы серодиагностики, необходимое для понимания закономерностей и взаимосвязей.
При введении в организмы позвоночных животных не через пищеварительный канал вирусы благодаря своей белковой оболочке действуют как антигены, т. е. побуждают иммунную систему к образованию антител. Как правило, антител образуется больше, чем необходимо для удаления введенного вируса. Их можно обнаружить в течение длительного времени в сыворотке крови, которую в данном случае мы называем антисывороткой. Необходимой предпосылкой приготовления антисывороток к фитопатогенным вирусам является получение высокоочищенных препаратов вирусов. Эти препараты вводят внутривенно или внутримышечно подопытным животным, чаще всего кроликам. После нескольких инъекций у кроликов берут кровь, также несколько раз. Сыворотку, содержащую антитела, отделяют от других компонентов крови и хранят в глубокозамороженном или лиофилизированном состоянии до употребления в серологических анализах.
Антигены — в данном случае фитопатогенные вирусы — и антитела могут при определенных условиях (среда, соотношение реагентов) реагировать друг с другом in vitro, т. е. вне животного организма. При этом возникают нерастворимые комплексы антиген — антитела, которые удерживаются нековалентными связями. Следует отметить, что эта реакция протекает весьма специфично, по принципу «ключ — замок». Поэтому вирусы могут реагировать только с соответствующими им антителами. На этом основывается высокая специфичность серологических методов.
Принцип серологических методов диагностики состоит в обнаружении образовавшихся комплексов антиген — антитело с помощью различных методик.
Агглютинация. Для теста агглютинации (ТА) используют неосветленные, т. е. нецентрифугированные, образцы сока. Кроме вирусов и антител, в реакции участвуют клеточные компоненты (пластиды, фрагменты протоплазмы и оболочек).
На обезжиренное предметное стекло пипеткой наносят раздельно две капли исследуемого сока, к одной из них добавляют каплю антисыворотки, к другой — каплю нормальной сыворотки (от неиммунизированного животного). Контролем служит такая же пара капель сока здорового растения на отдельном предметном стекле. Капли смеси сока с сыворотками хорошо перемешивают стеклянной палочкой и выдерживают при комнатной температуре (каждая стеклянная палочка используется только один раз!). Длительность выдерживания смешанных капель составляет от нескольких минут до получаса в зависимости от концентрации вируса, качества антисыворотки и окружающей температуры. Затем результаты реакции агглютинации наблюдают макроскопически или под микроскопом при малом увеличении с освещением в темном поле. Исследуемый сок с нормальной сывороткой и сок здорового растения остаются равномерно мутными, в соке зараженных проб появляются хорошо заметные хлопья.
Примечание. ТА — наиболее простая методика серологической диагностики, однако она имеет некоторые недостатки. Иногда встречаются неспецифические реакции, т. е. явления агглютинации в соке здоровых растений. Поэтому ТА целесообразно использовать в тех случаях, когда нужно быстро получить предварительные сведения о зараженности посева или пробы. Б окончательной проверке тест агглютинации применять нельзя. Данная методика в известной степени оправдана и при отсутствии возможности осветления сока центрифугированием.
К преимуществам ТА относятся следующие факторы: 1) возможность использования нецентрифугированного сока; 2) для оценки результатов необязательно применять микроскоп; 3) агглютинация начинается, как правило, уже через несколько минут и хорошо заметна (если речь идет о специфической реакции); 4) с помощью ТА можно диагностировать как палочковидные, так и сферические вирусные частницы.
Иногда для ТА используют стеклянные пробирки.
Преципитация (капельный тест). Если для серологического анализа используется центрифугированный сок, то реакция между антигеном и антителами протекает без участия клеточных фрагментов. Образующиеся при этом хлопья называют преципитатом.
Образцы сока, полученные с помощью ручного пресса или путем гомогенизации в ступке, центрифугируют 20—30 мин при 2500—5600 g (по возможности — в центрифуге с охлаждением). Скорость вращения зависит от исследуемой комбинации вирус — хозяин. После центрифугирования капли сока наносят пипеткой, как и при ТА, на предметные стекла или стеклянные пластинки. В каждую каплю добавляют равное количество антисыворотки или нормальной сыворотки и перемешивают капли стеклянной палочкой, доводя их диаметр до размера 10-копеечной монеты. После инкубации в течение 20—120 мин при 25°С и 70—80%-ной влажности воздуха считывают результаты в темном поле микроскопа с освещением при 50—70Х. Показателем положительной реакции служит образование легких хлопьев преципитата.
Примечание. Данный тест обладает более высокой специфичностью и чувствительностью, чем тест агглютинации. Однако и здесь возможны неспецифические реакции, обусловленные действием содержащихся в некоторых растениях ингибиторов серологических реакций. Поэтому необходим контроль с использованием сока здоровых растений и нормальной сыворотки.
По преципитату невозможно различить разные фракции антигена. Кроме того, чтение результатов реакций преципитации в темном поле требует некоторого опыта, особенно при очень слабых реакциях из-за низкой концентрации вируса в соке. Как правило, чем прозрачнее сок, тем отчетливее преципитат. Следовательно, для различных комбинаций вирус — хозяин необходимы разные буферные растворы, добавки, режимы центрифугирования, которые определяют путем пробных анализов или находят в специальной литературе. При избытке одного из партнеров (например, избыток антител) происходит торможение реакции, что проявляется в форме так называемой профазы, т. е. на первых ступенях разведения образование преципитата не происходит.
Тест преципитации одинаково пригоден для диагностики сферических и палочковидных вирусных частиц.
Микропреципитация под парафиновым маслом. Дно чашки Петри покрывают тонким слоем гидрофобного материала (1%-ный раствор мовитала или формвара — раствора пливинилформальдегида), который препятствует растеканию и слиянию капель. После высыхания пленки с помощью пипетки с вытянутым концом на равном расстоянии друг от друга рядами наносят капли центрифугированного сока исследуемых растений. Для равномерного размещения капель под чашку подкладываюг шаблон, размеченный на миллиметровой или обычной бумаге. К каждой капле добавляют антисыворотку или нормальную сыворотку и перемешивают капли стеклянной палочкой (капли сока и сывороток должны быть примерно равного объема). Чтобы мелкие капли не испарились, работу нужно проводить быстро. Затем с края чашки осторожно наливают парафиновое масло, которое удерживает капли на месте и плотно изолирует их от воздуха. Чашки Петри оставляют при комнатной температуре и через 3— 6 ч считывают результаты в темном поле микроскопа с освещением.
AS-тест. Для усовершенствования серологической диагностики вирусов картофеля X, Y, S и М Хаманн и Рунге разработали методику с использованием сульфата аммония. Его добавление к соку, помимо повышения способности вирусов к образованию осадка, вызывает коагуляцию низкомолекулярных белков и других мешающих серологической реакции веществ, которые затем удаляют путем центрифугирования на малых скоростях.
По 0,3 мл сока от каждой пробы, полученного с помощью вальцового пресса, помещают в пробирки и дозирующим шприцем добавляют по 0,3 мл 1,31%-ного раствора сульфата аммония. После инкубации в течение часа при 27 °С проводят центрифугирование в течение 20 мин при 2500—3000 g (по возможности — в центрифуге с охлаждением). Осветленный таким образом сок наносят на стеклянные палетки с подложенным шаблоном и стеклянной палочкой смешивают с антисывороткой (1:1). После трехчасовой инкубации при 27 °С и 100% — ной влажности воздуха считывают результаты при 60—70-кратном увеличении в темном поле микроскопа.
Преимущества AS-теста заключаются в следующем: 1) чистота реакционных смесей обеспечивает хорошую оценку результатов реакции; 2) реакция между антигеном и антителами протекает полнее, что позволяет обнаружить больше зараженных образцов, чем при тесте преципитации; 3) число неспецифических реакций резко снижается.
При использовании непрерывно работающих дозирующих пипеток и уменьшении числа контрольных капель с нормальной сывороткой на 50% AS-тест, дающий более достоверную диагностику, обеспечивает снижение затрат на 20 %.
Дальнейшим усовершенствованием этой методики является ASNA-тест. К 1,31%-ному раствору сульфата аммония добавляют 0,2% азида натрия, что дает возможность продлить инкубацию в течение ночи. Покрытие смешанных капель парафиновым маслом устраняет испарение, и в результате время инкубации можно продлить до 48—72 ч в зависимости от исследуемого материала, цели теста и концентрации вирусов. (Данный вариант методики сокращенно обозначается также ASNAP-тест, т. е. ASNA-тест под парафином.)
Преципитация при погружении. Тест преципитации при погружении по Рихтеру пригоден только для обнаружения вирусов, присутствующих в растениях в высокой концентрации (например, ВТМ в табаке).
На обезжиренное предметное стекло наносят в ряд мелкие капли антисыворотки и нормальной сыворотки. Свежий срез листа исследуемого растения быстро погружают 5—10 раз в каждую каплю, затем так же поступают с листом здорового растения (контроль). После 40-минутной инкубации в термостате при высокой влажности воздуха результаты считывают в темном поле микроскопа с боковым освещением.
Если соблюдены вышеуказанные условия, тест преципитации при погружении дает хорошие результаты благодаря своей простоте и быстроте. Кроме того, он не требует центрифугирования сока.
Кольцевая преципитация. В пробирки диаметром 2—3 мм наливают антисыворотку с добавлением 10% глицерина, разбавленную в разной степени физиологическим раствором. Исследуемый очищенный препарат вируса, также в различных разбавлениях, осторожно наслаивают на сыворотку. После инкубации в течение 1—2 ч проводят учет результатов в темном помещении с боковым освещением. Контролем служит нормальная сыворотка. При положительной реакции в зоне оптимального соотношения концентраций антигена и антител видно кольцевидное или дисковидное помутнение. Кольцевая преципитация предназначена, как правило, только для очищенных антигенов.
Двойная диффузия (тест Ухтерлони). Описанные выше тесты преципитации проводятся в жидкой среде. Однако можно применять и полужидкую среду, например агар, и в этом случае говорят о гель-тесте. Простую форму гель-теста представляет собой двойная диффузия в агаре.
В 100 мл физиологического раствора на водяной бане вываривают до осветления 1 г агара, затем добавляют 50 мг азида натрия для подавления роста микроорганизмов. По 10—15 мл теплого раствора разливают пипеткой в чашки Петри диаметром 9 см, установленные на строго горизонтальной поверхности, чтобы слой агара был равномерным. Чашки должны быть с ровным дном и без царапин, затрудняющих оценку результатов. После затвердения агара при комнатной температуре (лучше выдержать чашки в течение суток) с помощью пробочного сверла диаметром 3—5 мм, соединенного с вакуумным или водоструйным насосом, нарезают отверстия (лунки) по подложенному под чашку шаблону. Для удаления вырезанных дисков агара можно использовать пипетку, соединенную с водоструйным насосом.
Пробы растений, подлежащих исследованию, гомогенизируют в ступке с добавлением фосфатного или какого-то специального буфера, отжимают и вносят в лунки, обозначенные на схеме буквами АГ. В лунки, обозначенные буквами АС, вносится антисыворотка в рабочем разведении. При заполнении лунок нужно следить за тем, чтобы сок или антисыворотка не переливались через край лунки, это затрудняет считывание результатов реакций. На крышке чашки надписывают наименование проб и антисыворотки. После 24-часовой инкубации в термостате при 24 °С результаты считывают в темном помещении с боковым освещением.
При двойной диффузии также целесообразно использовать в качестве контроля здоровые растения и проводить анализ в нескольких повторениях. При положительной реакции между лунками с антигеном и антисывороткой появляется белая линия или штрих в зависимости от комбинации вирус — хозяин. Реакция происходит в результате диффузии в агар вируса и антител, которые при встрече образуют преципитат.
Линии, расположенные ближе к лунке с антисывороткой или точно посредине между лунками, указывают на неспецифические реакции. С этим связана необходимость включать в анализ контрольные варианты со здоровыми растениями.
Примечание. Как уже указывалось, тест двойной диффузии в первую очередь пригоден для диагностики сферических вирусов. При диагностике палочковидных вирусов с нормальной длиной частиц более 300 нм следует или повысить проницаемость геля путем снижения концентрации агара (0,8%-ный), или разрушить вирусные частицы путем добавления к исследуемому образцу пиридина, пирролидина, детергентов. Слабые линии преципитации можно сделать более заметными путем окрашивания или усилить путем повторного добавления антигена в лунку. Если исследование проводится по не описанной в литературе методике, необходимо в предварительных опытах определить оптимальное разведение антисыворотки и расстояние между лунками с антигеном и антисывороткой.
Тест двойной диффузии может быть использован также для количественных анализов. Агаровые пластинки готовят по схеме, с соответствующим расположением лунок. Затем получают различные разведения сока исследуемого растения в фосфатном буфере (от 1:1 до 1:512), которые в порядке возрастания вносят в лунки. Антисыворотку используют в постоянном разведении (примерно на 2—3 ступени ниже титра сыворотки). В обратном случае, т. е. при постоянной концентрации антигена и различных разведениях сыворотки, можно определить ее титр. Антиген вносится в неразведенном виде (соотношение гомогената и фосфатного буфера 1:1). Степень разведения, при которой еще видна линия преципитации, соответствует титру антисыворотки или антигена. Чашки в опытах по определению титра инкубируют в термостате в течение 48 ч.
Радиальная иммунодиффузия (РИД-тест). При радиальной иммунодиффузии антисыворотка смешивается с агаром, поэтому вирусы, диффундирующие в агар радиально, сразу же встречаются с антителами. Положительная реакция проявляется в виде белого более или менее широкого кольца вокруг лунки.
Для проведения анализа 3 г агара в 75 мл буферного раствора кипятят на водяной бане до получения прозрачного раствора (примерно 30 мин) и добавляют 50 мг азида натрия. В остывший до 50 °С раствор вводят 25 мл предварительно подогретой антисыворотки в соответствующем разбавлении, тщательно встряхивают и сразу разливают по 10 или 15 мл в подогретые чашки Петри диаметром 10 см, установленные на горизонтальной плоскости.
Сок исследуемых растений получают в ступке с добавлением буферного раствора и вносят в лунки. Уже через несколько часов (в зависимости от диагностируемого вируса и его концентрации) проводится оценка результатов в темном помещении с боковым освещением. При этой методике также целесообразно включать контрольные варианты для выявления возможных неспецифических реакций.
Тест радиальной иммунодиффузии пригоден не только для качественного, но и для количественного определения фитопатогенных вирусов, поскольку ширина кольца прямо пропорциональна концентрации вируса.
Примечание. Радиальную иммунодиффузию до сих пор успешно применяли для диагностики вируса шарки сливы и вирусов картофеля. Деградация, т. е. распад палочковидных вирусов на субъединицы, обеспечивается путем добавления пирролидина или пиридина. Для вирусов, поражающих картофель, 0,7 мл сока смешивают с 0,3 мл пиридина. Готовые для анализа чашки Петри, в которых можно проводить большое число отдельных тестов (от 80 до 100), поставляются специальными учреждениями. Это позволяет свести до минимума затраты труда на исследования.
Латекс-тест. При латекс-тесте в серологической реакции, кроме вируса и антител, участвуют частицы латекса, на которых адсорбированы антитела (сенсибилизация). Поэтому даже при сравнительно низких концентрациях вирусов можно получить видимые реакции. В сравнении с тестом преципитации латекс-тест более чувствителен, причем, как правило, возрастает и достоверность диагностики.
Антитела из применяемых сывороток осаждают путем диализа против 25%-ного раствора сульфата аммония, осадок отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 200 g и растворяют в 0,85%-ном растворе NaCl (1/10 или 1/20 исходного объема). Затем готовят ряд последовательных разведений раствора антител в 0,2 М трис-HCl буфере с pH 7,2 в зависимости от титра (1: 500, 1:1000, 1: 2000, 1: 4000 и 1: 6000), сенсибилизируют по Берксу Дифко-бакто-латексом 0,81 или основной суспензией латекса для RF-теста и уточняют оптимальную степень разведения для дальнейших опытов.
Вышеуказанные препараты латекса смешивают в соотношении 1 14 с 0,9%-ным раствором NaCl. Затем смесь одной части осажденного и разбавленного глобулина и одной части разбавленной суспензии латекса центрифугируют 30 мин при 5000 g. Осадок промывают 0,2 М трис-HCl буфером с pH 7,2, добавив 2% поливинилпирролидона (1%-ный раствор) в дистиллированной воде, так чтобы объем буфера соответствовал исходному объему разбавленной сыворотки. После повторного центрифугирования в течение 30 мин при 5000 g проводят еще две промывки и последний раз центрифугируют (30 мин при 5000 g). Осадок суспендируют в 0,2 М трис-HCl буфере с добавлением 2% ПВП, причем в отличие от методики Беркса количество буфера соответствует половине объема разбавленной сыворотки.
Сыворотки, сенсибилизированные описанным способом, можно хранить в холодильнике при 4°С в течение нескольких лет.
Практическое проведение латекс-теста в отличие от методики сенсибилизации очень просто. По капле сенсибилизированной сыворотки и центрифугированного сока исследуемого растения наносят пипеткой на предметное стекло со шлифованным мениском и зачерненной обратной стороной. Затем стекла со смешанными каплями встряхивают с малой амплитудой в течение 20 мин на качалке. Несколько предметных стекол рекомендуется наклеить на стеклянную пластинку соответствующего размера. Положительную реакцию — хлопья — видно невооруженным глазом, а также под лупой или бинокуляром, в то время как капли с соком здоровых растений остаются равномерно мутными, молочно-белыми. Не следует пренебрегать постановкой контрольных тестов, в частности со смесью сока исследуемого растения и антисыворотки к вирусу, который заведомо отсутствует в испытываемом растении.
Из-за простоты методики и сравнительно низких затрат труда латекс-тест вполне пригоден для серийной диагностики. Например, разработаны методы определения вирусов некротической и хлоротической кольцевой пятнистости вишни, хлоротической пятнистости яблони, некротической желтухи свеклы, европейской мозаики кукурузы и кустистой карликовости томата в черешне.
Латекс-тест успешно применяют также для диагностики вирусов, поражающих картофель.
Примечание. Сенсибилизация сывороток обычно проводится в специально оборудованных вирусологических лабораториях, готовые к употреблению сыворотки поставляются потребителям. Однако потребность в оборудовании при этом невелика, такую работу можно организовать в менее специализированных лабораториях.
Для сенсибилизации пригодны и другие инертные частицы — эритроциты барана, бентонит, сульфат бария, хотя соответствующие методики для практической серодиагностики пока не разработаны.
Иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА применяют в тех случаях, когда из-за низкой концентрации фитопатогенных вирусов в растениях или наличия в растительных экстрактах веществ, мешающих реакции (фенолы, танины), обычные серологические методы диагностики непригодны.
Высокая чувствительность ИФА дает возможность использовать антиген в высоких разведениях. Этот способ позволяет исключить действие мешающих веществ и получать специфические результаты диагностики вирусов. С 1976 г. с помощью ИФА. успешно определяют различные фитопатогенные вирусы. Разработано несколько модификаций метода, например Рихтером с соавт.
Первый этап ИФА — адсорбция антител на поверхности носителя, которые связывают соответствующие антигены из исследуемого раствора. Фиксированный на носителе комплекс антиген — антитела обнаруживают путем добавления антител, меченных ферментом. Затем с помощью подходящего субстрата можно обнаружить комплекс антитела — антиген — меченые антитела. Субстратом служит р-нитрофенилфосфат, а ферментом-меткой — главным образом щелочная фосфатаза, которую с помощью глутаральдегида конъюгируют с фракциями антисывороток или очищенными антителами. Таким образом, проявление иммунологической реакции связано не с непосредственным выпадением осадка, как при тестах преципитации в жидкой или твердой среде, а с активностью фермента, выражающейся в расщеплении субстрата. Действие фермента заметно даже при малых era количествах, поэтому метод обладает высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать антиген либо антитела в минимальных концентрациях.
Методика проведения ИФА в модификации Рихтера с соавт. состоит из следующих этапов:
— в лунки на налете из прозрачного поливинилхлорида вносят по 200 мкл раствора фракции иммуноглобулинов с коэффициентом седиментации 7S в 0,05 М карбонатном буфере с pH 9,6 и инкубируют 3 ч при 37 °С;
— лунки промывают 4 раза фосфатным буфером с NaCl (PBS) и 0,05% твина 20, затем с палет стряхивают капли раствора;
— вносят по 200 мкл гомогената исследуемых проб (в PBS с твином и 2% поливинилпирролидона), разбавленного, как указано ниже; инкубация в течение 18 ч при 4°С;
— лунки промывают, как указано выше;
— вносят по 200 мкл раствора меченных ферментом антител и инкубируют 4 ч при37°С;
— лунки промывают, как указано выше;
— вносят по 300 мкл субстрата (0,06%нный раствор р-нитрофенилфосфата в 10% диэтиламинового буфера, pH 9,8);
— инкубируют при комнатной температуре;
— реакцию останавливают через 80 мин путем добавления 50 мкл 2 и NaOH.
Реакцию обнаруживают по изменению окраски субстрата. Щелочная фосфатаза, конъюгировавшая с антителами, расщепляет р-нитрофенилфосфат с образованием желтого р-нитрофенола. Степень окрашивания зависит от концентрации вируса в образце. Оценку реакций проводят визуально или с помощью спектрофотометра с измерителем экстинкции при длине волны 405 нм.
Примечание. Для диагностики определенных вирусов (например, вируса хлоротической пятнистости яблони) описанная методика требует некоторых изменений: конъюгат вносят в лунку одновременно с исследуемой пробой. В другом варианте ИФА ферментом служит пероксидаза из хрена, а субстратом — ортофенилендиамин. В этом случае реакцию останавливают 4 М серной кислотой и измеряют коричневатое окрашивание субстрата при длине волны 490 нм.
Помимо высокой чувствительности преимущество ИФА состоит в том, что он пригоден для диагностики вирусов любой морфологии. При наличии соответствующего оборудования один лаборант может проанализировать за рабочий день примерно 1000 проб.
Весьма вероятно, что в ближайшие годы ИФА найдет применение для тестирования плодовых деревьев и диагностики вирусов картофеля. Подготовительные работы смогут взять на себя специально оборудованные вирусологические лаборатории, т. е. потребители будут получать уже готовые налеты с адсорбированными в лунках антителами. Тогда для практического применения ИФА потребуются сравнительно небольшие затраты на оборудование.
Поскольку перед проведением ИФА в каждом отдельном случае необходима соответствующая подготовка в специальной лаборатории, более детального описания методики здесь можно не приводить. Все упомянутые буферные растворы готовят но Кларку и Адамсу.