Ввиду отсутствия у Br. ovis поверхностно-оболочечного S-антигена бруцелл у инфицированных животных в крови образуются только О-антитела.
Поэтому серологическая диагностика заболевания основана на взаимодействии позитивной сыворотки больных животных с глубинным О-антигеном клеток Br. ovis в РДСК.
Компоненты для РДСК. Для реакции длительного связывания комплемента (РДСК) используются те же компоненты, которые применяют для РСК (реакция связывания комплемента). Однако способ подготовки некоторых из них имеет свои особенности.
Антиген для РДСК. Антиген Br. ovis изготовляют следующим образом. Культуры двух отобранных высокоантигенных штаммов (№ 424 и 10) Br. ovis выращивают на 20%-ном сывороточном ППГГА в течение 4 сут. Через 4 сут после посева все посевные колбы проверяют на чистоту роста. Мазки окрашивают по Граму и просматривают под микроскопом. Из посевных колб сливают весь конденсат и вводят в них стерильный изотонический раствор хлорида натрия (0,85%-ный), pH 6,8. Микробную взвесь обоих штаммов (№ 424 и 10) объединяют. Взвесь клеток Br. ovis в концентрации 120—130 млрд. микробных тел в 1 мл в колбах вместимостью 1 л прогревают в кипящей водяной бане в течение 2,5 ч. Более высокую концентрацию взвеси разбавляют до нужной стерильным изотоническим раствором хлорида натрия.
Подготовленную указанным образом взвесь микробных клеток подвергают 4-кратному замораживанию и оттаиванию. Взвесь замораживают при температуре — 18… —20° С в течение 4—5 ч, а затем медленно оттаивают в термостате или в водяной бане при температуре 37-40° С.
После последнего оттаивания взвесь выдерживают в холодильнике при температуре 0…+40 С в течение 5 сут при периодическом 5—6-разовом встряхивании в сутки. Затем центрифугируют при 4—4,5 тыс. об/мин в течение 3,5—4 ч. Слегка опалесцирующая надосадочная жидкость и является антигеном.
Надосадочную жидкость (антиген) консервируют путем добавления 0,3% формалина, после чего выдерживают 6 ч в термостате при 37— 38° С.
Антиген Br. ovis не должен обладать самозадерживающими свойствами в разведении 1 : 10 при постановке РДСК со свежими (1—2-суточными) сыворотками крови в разведении 1 : 5 и 1 : 10.
Исследуемые и контрольные сыворотки. При постановке РДСК, помимо сывороток, поступивших для диагностического исследования, используются еще 2 типа сывороток: 1) негативные — для контроля реакции и титрования гемолитической системы; 2) позитивные против Br. ovis.
Исследуемые сыворотки должны быть свежие, полученные не более как за 1—2 сут и хранившиеся при 2—4° С. Допускается исследование консервированных сывороток. Сыворотки, предназначающиеся для титрования гемолитической системы контроля реакции, получают от здоровых баранов (овец). Кровь берут в смонтированные для стерильного взятия цилиндры и отстаивают 3—4 сут. Отстоявшуюся сыворотку (без эритроцитов) декантируют в стерильные колбы, вносят 4% химически чистой борной кислоты и прогревают в водяной бане при 55° С при легком встряхивании в течение 30 мин (до растворения кристаллов кислоты). Затем сыворотку расфасовывают в стерильные флаконы и хранят, в холодильном шкафу. Срок годности сывороток 1 год.
Комплемент. Для РДСК берут сухой биофабричный комплемент или жидкий, консервированный 4% химически чистой борной кислоты и 5% химически чистого сернокислого натрия. Сухой комплемент разводят перед употреблением путем введения в ампулу 1 мл изотонического раствора хлорида натрия, а не 2 мл, как это принято при его разведении для РСК. Данная серия сухого или жидкого комплемента считается пригодной, если он имеет титр не менее 0,28 при его титровании в гемолитической системе. Для титрования в гемолитической системе исходный комплемент жидкий (консервированный) или сухой после введения в ампулу 1 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия берут в разведении 1 : 20. Если комплемент в гемолитической системе имеет титр от 0,1 до 0,22, то его разводят для главного опыта 1 : 30, более слабый комплемент разводят 1 : 20. Один раз оттитрованный в гемолитической системе сухой комплемент данной серии больше не титруют в течение года. Жидкий консервированный комплемент используют без перетитровок 2 мес. Слабый комплемент, полученный от морских свинок в лабораториях (в особенности в весеннее время), усиливают сухим комплементом из расчета на каждые 5 мл нативного комплемента 1 ампула сухого. В данном опыте гемолитическая система изготовлена из равных объемов 2,5%-ной взвеси отмытых эритроцитов барана (овцы) и разведенного гемолизина, взятого в тройном титре.
По схеме полный гемолиз эритроцитов наблюдался в 8 пробирках, начиная с пробирки № 3, где доза комплемента была 0,16 (разведенного 1 : 20). Следовательно, комплемент данной серии при постановке РДСК должен браться в разведении 1 : 30 (из ампулы, в которую вводят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия). Если бы частичная задержка гемолиза наблюдалась при титровании гемолитической системы с дозой сухого комплемента от 0,22 мл до 0,28 мл, в РДСК такой комплемент следовало бы брать в разведении 1 : 20. Ориентировочное титрование каждой серии комплемента в гемолитической системе проводят один раз.
Титрование комплемента в гемолитической системе проводят только с целью установления его активности. Дозу же комплемента в главном опыте устанавливают при каждой постановке реакции путем титрования гемолитической системы для РДСК.
Жидкий консервированный комплемент, оттитрованный в гемолитической системе, может использоваться в установленной дозе в течение 2 мес.
Гемолитическая система. Гемолитическую систему для РДСК готовят из равных объемов 4%-ной взвеси эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и разведенного гемолизина в четверном титре. Взвесь эритроцитов делают из осадка после 2-кратного их промывания на центрифуге (10—12 мин при 3—3,5 тыс. об/мин).
Гемолитическую систему титруют по схеме постановки РДСК параллельно с главным опытом. Цель этого титрования состоит в том, чтобы установить, какое количество комплемента сохраняется в активном состоянии в главном опыте с отрицательными сыворотками после выдерживания их на холоде в течение 16—18 ч, т. е. какое количество гемолитической системы полностью лизируется через этот срок под влиянием комплемента, сохранившего активность.
Гемолизин (антисыворотка против эритроцитов барана) консервируют на биофабрике глицерином в равных частях. Поэтому для получения раствора гемолизина в четверном титре расчет производят следующим образом. Например, требуется изготовить 500 мл гемолитической системы. Приготавливают 250 мл 4%-ной (с осадка) взвеси эритроцитов отмытых 2 раза на центрифуге. Во второй колбе приготавливают 250 мл гемолизина при титре, указанном на этикетке ампулы (1 : 2000). Следовательно, в колбу необходимо ввести следующее количество гемолизина 1 мл и добавить 249 мл изотонического раствора хлорида натрия. Затем разведенный гемолизин (250 мл) переливают при энергичном помешивании в разведенные эритроциты (250 мл). Необходимо отметить, что избыток гемолизина до пятерного и выше титра не влияет отрицательно на ход реакции, тогда как его недостаток всегда вызывает частичную задержку гемолиза в отрицательных пробах. Поэтому титр гемолизина, указанный на этикетке, должен быть проверен и уменьшен, если гемолизин в процессе хранения снизил активность.
Пробирки для гемолитической системы и пробирки главного опыта выдерживают при температуре 0—4 С в течение 16—18 ч. По истечении этого срока пробирки с гемолитической системой вместе с пробирками главного опыта переносят в лабораторию и титруют по схеме, показанной в табл. 66.
Титром гемолитической системы является наибольшее ее количество, в котором полностью гемолизируются эритроциты в двух нормальных сыворотках через 20 мин после выдерживания их в водяной бане при температуре 37—38 С. Рабочий титр гемолитической системы, т. е. ее количество для введения в пробирки с главным опытом, будет на один интервал меньше. Например, общий титр равен 1 мл, а рабочий — 0,8 мл гемолитической системы.
При титровании гемолитической системы необходимо соблюдать следующие два правила. Во-первых, обе нормальные сыворотки берут только специально подготовленные для этой цели. Могут быть использованы те сыворотки, которые высылаются в наборе вместе с антигеном Br. ovis, либо приготовленные, как это указано выше, на месте.
Нельзя пользоваться сыворотками из партий, поступающих на исследование независимо от благополучия хозяйств, из которых они поступили. Во-вторых, антиген и комплемент вводят в пробирки титрования гемолитической системы из тех же емкостей, в которых они были разведены и использовались для главного опыта.
Изотонический раствор хлорида натрия. Или разведения всех компонентов РДСК применяют изотонический раствор химически чистого хлорида натрия. Дистиллированная вода и изотопический раствор должны иметь pH 6,3—6,8. После приготовления изотонический раствор прогревают до начала кипения. Комплемент, разведенный в изотоническом растворе хлорида натрия, необратимо разрушается при pH ниже 5,5 и выше 8.
Методика постановки РДСК. Наблюдения покапывают, что РДСК при правильном ее применении является высокочувствительным методом диагностики заболевания овец, вызываемого Br. ovis.
Последовательность постановки реакции. В настоящее время считается признанной следующая последовательность постановки РДСК.
1. Разливают испытуемые и контрольные сыворотки каждую в три пробирки. В первую пробирку вводят 0,1 мл сыворотки, во вторую — 0,05 мл и в третью — 0,2 мл. Первые две пробирки служат для опыта с антигеном, третья — для контроля сыворотки на самосдерживающие свойства — без антигена. В практических условиях поступают следующим образом. В одну пробирку, служащую для контроля, вводят предварительно 1,6 мл изотонического раствора хлорида натрия, в третью 0,5 мл (во вторую не вводят). Затем в первую пробирку вносят 0,4 мл испытуемой или контрольной сыворотки, тщательно смешивают, после чего берут 1 мл смеси и по 0,5 мл вводят во вторую (пустую) и в третью пробирки. После тщательного смешивания (двукратное всасывание и выдувание жидкости) содержимого пробирок из третьей пробирки удаляют 0,5 мл жидкости. Следовательно, во всех трех пробирках получается требуемое количество сыворотки.
2. Разливают две известные разведенные 1 : 10 негативные сыворотки, предназначаемые для титрования гемолитической системы, каждую в 8 пробирок по 0,5 мл.
3. Производят инактивирование в водяной бане при 64—65 С всех разлитых сывороток в течение 30 мин.
4. Вводят антиген, разведенный по титру по 0,5 мл, во все пробирки с разведенными сыворотками в главном опыте (исключая контрольные с дозой сыворотки 0,2 мл), а также во все пробирки, предназначенные для титрования гемолитической системы.
5. Вводят комплемент в разведении 1 : 30 или 1 : 20 в зависимости от его активности, определяемой методов титрования в гемолитической системе для РДСК, по 0,5 мл во все пробирки главного опыта и в пробирки, предназначенные для титрования гемолитической системы. Сухой комплемент предварительно разводят путем введения в каждую ампулу 1 мл изотонического раствора хлорида натрия (основное разведение) из их содержимого и делают разведение 1 : 20 или 1 : 30.
6. Приготавливают гемолитическую систему для РДСК.
7. Выдерживают при температуре 0—4° С в течение 16—18 ч все пробирки главного опыта и гемолитической Системы и приготовленную гемолитическую систему.
8. Титруют гемолитическую систему и определяют ее рабочую дозу для главного опыта.
9. Вводят во все пробирки главного опыта установленную дозу гемолитической системы, выдерживают в водяной бане при 37—38° С в течение 20 мин и учитывают результаты.
Учет результатов РДСК. Результаты реакции учитывают через 2—3 ч после окончания опыта, т. е. извлечения пробирок главного опыта из водяной бани или на следующий день. Вначале учитывают общие контроли (контроля антигена, эритроцитов, позитивной и негативной сывороток), при соответствии показаний всех контролей производят учет главного опыта. Исследуемые сыворотки учитывают, начиная с первой пробирки (контроль сыворотки на самозадержку без антигена). Если в этой пробирке произошел полный гемолиз эритроцитов, учитывают результат в двух других пробирках с антигеном (во второй и третьей). При незначительной задержке гемолиза в первой пробирке учет этой пробы сыворотки не производят.
Реакцию считают положительной, если в обеих пробирках с антигеном будет полная (0% гемолиза) или выраженная задержка гемолиза, не менее двух крестов в каждой пробирке (50% гемолиза) или более выраженная 3—4 креста задержка гемолиза (25—0% гемолиза).
К сомнительным относят такие реакции, когда задержка гемолиза будет менее выражена, например 2 креста в одной из пробирок и один крест в другой или более низкие показатели. Положительные и сомнительные пробы подлежат повторному исследованию. Повторное исследование начинают после учета результатов первого исследования. Сомнительно реагирующих животных исследуют повторно через 3—4 нед. При получении повторно сомнительных результатов животных признают больными.
К отрицательным результатам относят такие, когда во всех трех пробирках с исследуемой сывороткой будет получен полный гемолиз эритроцитов.
Некоторые особенности РДСК. П. А. Триленко, (1956), изучая РСК на холоде с сыворотками крупного рогатого скота при бруцеллезе, установил, что в процессе длительного выдерживания первой фазы реакции с негативной сывороткой при температуре 0—4° С часто возникают такие условия, при которых через 16—18 ч проявляется более или менее выраженная неспецифическая задержка гемолиза. Причем задержка гемолиза прямо зависит от длительности выдерживания реакции для связи антитела с антигеном (первая фаза). Это происходит потому, что частично в этих условиях разрушается комплемент.
Задержка гемолиза при постановке РСК обычно не успевает проявиться, если первая фаза реакции с негативной сывороткой (связывание) происходит в течение 20—30 мин при температуре 37—38° С, т. е. при постановке РСК классическим способом. Но при связывании комплемента на холоде в течение 16—18 ч неспецифическая задержка гемолиза успевает проявиться в большей или меньшей степени. Следовательно, требуется какое-то добавочное количество комплемента, чтобы во второй фазе РСК (гемолизин + эритроциты) наступил полный гемолиз эритроцитов в пробирках с нормальными сыворотками. Поскольку у сывороток разных партии неодинаково возникает антикомплементарность в процессе связывания комплемента на холоде, то произвольные надбавки комплемента к заранее оттитрованной его дозе могут приводить к неправильному результату. Предусмотреть степень разрушения комплемента в процессе длительного его связывания невозможно, так как это зависит от нескольких причин, например от давности получения исследуемых сывороток, условий их взятия, хранения и доставки. Поэтому долгое время методики РСК, рассчитанные на связь первой фазы реакции на холоде, не получали широкого практического применения, несмотря на их потенциальную более высокую чувствительность в сравнении с классической методикой РСК.
Мы провели специальные опыты для установления причин неспецифической адсорбции комплемента в период первой фазы РСК на холоде. Опытами было установлено, что свежие сыворотки крупного рогатого скота, овец, коз и лошадей, инактивированные в водяной бане при 56—58° С в течение 20—30 мин, в период связывания на холоде (16—18 ч при 0—4 С) в большей или меньшей степени восстанавливают свойство неспецифической адсорбции комплемента, ликвидированное на более короткий срок нагреванием при указанных выше температурах. Нормальные инактивированные сыворотки крупного рогатого скота и других животных обладают антикомплементарностью, выраженной в разной степени. При нагревании в пределах 56—58 С происходит укрупнение молекул белковых частиц в сыворотке и их относительная стабилизация, что снимает антикомплементарность на указанный срок. Если же сыворотки инактивировать при температуре 63—65 С в течение 30 мин, то при тех же условиях в тот же срок (16—18 ч при 0—4 С) антикомплементарность сывороток не восстанавливается. Антитела же начинают разрушаться только при нагревании сывороток до 70 С.
На основании указанных опытов установлено, что оптимальной температурой, необходимой для инактивирования сывороток крови крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей при выдерживании первой фазы РДСК при 0—4 С в течение 16—18 ч, является температура 64—65° С, а для сывороток крови кроликов и морских свинок 65 С при экспозиции 30 мин. При такой температуре в течение 30 мин антитела не разрушаются. Вместе с тем на весь период связывания сывороток с антигеном на холоде инактивированные сыворотки не восстанавливают свойство неспецифической адсорбции комплемента. В наших опытах сыворотки инактивировались в разведении 1 : 5 и 1 : 10 изотоническим раствором хлорида натрия.
В процессе изучения оптимальных условий постановки РДСК на холоде возник еще один важный вопрос. Выше было упомянуто о том, что комплемент обладает свойством частично разрушаться при 13-18-часовом выдерживании его при температуре 0—4° С совестно с компонентами первой фазы РСК. Следовательно, если производить титрование комплемента до постановки первой фазы реакции на связь при указанной температуре и вводить в опыт оттитрованную дозу комплемента, то после связывания эта доза комплемента будет уже не соответствующей, уменьшенной, что приведет к задержке гемолиза в пробирках, в которых выдерживается первая фаза реакции на холоде, т. е. результат исследования учету не подлежит.
Нашими опытами установлено, что можно определить количество активного комплемента после выдерживания первой фазы реакции (сыворотка + антиген + комплемент) на холоде в течение 16—18 ч. Для этого требуется установить максимальное количество эритроцитов, полностью лизирующихся в пробах с отрицательной (нормальной) сывороткой уже после связывания комплемента на холоде, т. е. провести опыт титрования гемолитической системы на серии пробирок первой фазы РДСК с отрицательной нормальной сывороткой, антигеном и комплементом. Комплемент и антиген берут в такой же дозе, как и для главного опыта и из того же сосуда, а следовательно, то же самое разведение компонентов, из которого эти компоненты брались для главного опыта, гак как в отдельном разведении антигена и особенно комплемента может не быть точного его соответствия с тем, которое разводится для главного опыта.
После учета результатов опытов, изложенных выше, определилась новая модификация РСК, названная нами реакцией длительного связывания комплемента — РДСК (П. А. Триленко, 1956, 1970). Эта реакция в отличие от РСК имеет следующие особенности.
1. Ииактивирование исследуемых сывороток производится при температуре от 64 до 65° С в течение 30 мин. Этим достигается некоторое укрупнение молекул белка сывороток, стабилизация колоидной системы сывороток и предупреждается неспецифическая адсорбция комплемента в процессе длительного связывания его на холоде при температуре 0—4° С в течение 16—18 ч.
2. Определяется сохранившееся в активном состоянии количество комплемента в пробирках с негативными сыворотками уже после называния первой фазы реакции (сыворотка + антиген + комплемент) на холоде при температуре 0—4° С в течение 16 — 18 ч. Это достигается титрованием гемолитической системы по схеме главного опыта РДСК на двух известных нормальных сыворотках.
3. В пробирки главного опыта после связывания первой фазы на холоде вводят оттитрованную дозу гемолитической системы, соответственную дозе комплемента, способного после связывания (при 0—4° С в течение 16—18 ч) полностью лизировать эритроциты в присутствии гемолизина в нормальных сыворотках.
При исследовании иммунных сывороток, содержащих разное количество антител, по схеме РДСК осуществляется наиболее полное взаимодействие между антигеном и антителом (длительная связь на холоде) и наиболее оптимальное соотношение компонентов при завершении главного опыта (вводится оптимальное количество гемолитической системы после связывания комплемента на холоде).
Указанные особенности РДСК определяют более высокую ее чувствительность в сравнении с РСК и строгую специфичность.
Особенно большое преимущество РДСК в сравнении с РСК проявляется при исследовании сывороток, иммунных не к поверхностно-оболочечному S-антигену патогенных микроорганизмов, а к подоболочечному О-антигену. В течение многих лет при изучении реакции антиген — антитело при бруцеллезе главное внимание уделялось антигенным частицам, расположенным на поверхности микробном клетки. Бойд (1969) указывает, что антитела связываются с теми химическими структурами антигенов или клеток, которые находятся на их поверхности (подчеркнуто автором). Если в качестве антигена берется цельная клетка, то, естественно, в РА будет определяться только то антитело, которое имеет иммунное родство к антигену, расположенному на поверхности микробной клетки. Но микроорганизмы имеют два и более гетерологичных в иммунном отношении антигена. Следовательно, в сыворотке крови больных животных будет столько гетерологичных антител, сколько антигенов имеет возбудитель.
Наши исследования антигенной структуры неизмененных бруцелл показали, что у бруцелл видов Br. abortus, Br. suis, Br. melitensis, помимо поверхностно-оболочечного S-антигена, имеется подоболочечный (глубинный О-антиген бруцелл). Оба антигена в иммунном отношении гетерологичны. Феномен реакции агглютинации может проявляться только с S-антигеном, тогда как с О-антигеном реакция агглютинации не проявляется ввиду того, что О-антиген с поверхности закрыт молекулами, детерминирующими S-антиген. Br. ovis в неизмененном виде имеет только О-антиген. Поэтому именно для диагностики заболевания, вызываемого Br. ovis, больше, чем для заболеваний, вызываемых другими видами бруцелл, целесообразно практическое применение реакций, при постановке которых используется экстракт — антиген.
Следовательно, при серологической диагностике инфекционного заболевания овец, вызываемого Br. ovis, РА, ставящаяся с корпускулярным антигеном, не может с успехом применяться для целей индивидуальной диагностики и для оздоровления отар баранов. Она может иметь лишь разведывательное значение при групповой пробе. Преимущество РДСК перед РСК, по-видимому, зависит оттого, что более мелкие молекулы глубинного О-антигена бруцелл менее сложны и имеют более простую конфигурацию по сравнению с более крупными и более сложными по строению молекулами поверхностно-оболочечного S-антигена. Таким образом, для того, чтобы осуществить более прочную связь между О-антителом и О-антигеном, требуются больше времени и наиболее оптимальные условия, чем для проявления связи между более активными компонентами — S-антигеном и S-антителом бруцелл.
Всестороннее обследование первичного очага инфекции по РСК и РДСК было проведено в 1967 г. комиссией в г. Старая Русса. Было установлено, что положительно и сомнительно реагирующих по РДСК с антигеном Br ovis было 36 баранов, а по РСК— 12. Больные бараны не реагировали ни по РСК, ни по РДСК на бруцеллез со стандартными антигенами. Для бактериологического и патологоанатомического обследования 31 баран был убит. Из них у 24 обнаружены патологоанатомические изменения, характерные для инфекционного эпидидимита. От 7 баранов выделены культуры Br. ovis.
К. Махамбетов (1973) сообщает об обследовании по РДСК и РСК с антигеном Br. ovis 1036 племенных баранов. Реагирующих положительно по РДСК было 220 баранов (21,2%), сомнительно — 22 (2,11%). По РСК положительно реагировали только 123 барана (11,8%) и сомнительно — 32 (3,08%).
Специфичность РДСК, совпадение ее результатов с бактериологическими находками изучались Б. Н. Афанасьевым и Ф. А. Залихановой (1973). Ими была исследована бактериологически на наличие Br. ovis сперма от 29 баранов, реагирующих по РДСК с антигеном Br. ovis. Культура Br. ovis была выделена авторами от 19 баранов. Имели выраженную клиническую картину, характерную для заболевания, вызываемого Br. ovis, 16 баранов.
Более подробные исследования специфичности РДСК были проведены Б. Н. Афанасьевым (1974) на племенных баранах двух станций искусственного осеменения и четырех крупных овцеводческих хозяйств Ставропольского края. По данным автора (1974), у племенных баранов, реагирующих по РДСК с антигеном Br. ovis, возбудитель заболевания обнаруживается в сперме в 74,4% случаев. Из спермы низкого качества, получаемой от племенных баранов, реагировавших по РДСК, но не имевших клинических признаков болезни, возбудитель болезни был выделен от 86,6% проб, от баранов же с разнившейся клинической картиной он обнаруживался в 68,7% случаев.
Важные исследования проведены П. П. Гавриловым с соавторами (! 972) по изучению сроков исследования на инфекционное заболевание овец, вызываемое Br. ovis, ранее привитых вакциной из штамма.№ 19. В отдельных хозяйствах авторы обнаруживали до 54% реагирующих по РДСК с антигеном Br. ovis баранов, при этом до 70% из них имели клинические признаки инфекционного эпидидимита. Эти животные, однако, не реагировали на бруцеллез по РСК и РА со стандартными антигенами. Овец, отобранных авторами для параллельного исследования на инфекцию, вызываемую Br. ovis, и бруцеллез, ежегодно прививали вакциной из штамма № 19.
Полученные данные позволили авторам сделать вывод о том, что вакцинация овец вакциной из штамма № 19 не влияет на показания РДСК с антигеном Br. ovis у животных, если ее применять для исследования через 5 мес после их вакцинации или ревакцинации.
П. П. Гаврилов (1974) уточнил эти сроки и допускает возможность проводить исследования на выявление инфекционного заболевания, вызываемого Br. ovis, по РДСК через 3 мес после ревакцинации овец вакциной из штамма № 19. Специальные опыты, проведенные в этом направлении Б. Н. Афанасьевым (1974), убедительно свидетельствуют о том, что уже через 2 мес после вакцинации или ревакцинации овец вакциной из штамма № 19 их можно исследовать на инфекционное заболевание, вызываемое Br. ovis, методом РДСК с антигеном, изготовленным из клеток Br. ovis.