Реакция гидролиза-синтеза бензилпенициллина является обратимой.
Синтез идет, если реакционную смесь, содержащую 6-АПК, фенилуксусную кислоту и взвесь клеток, выдерживать при pH 4,0—6,0.
Ферментативный синтез бензилпенициллина протекает значительно быстрее и с более высоким выходом, если компонентом реакции с 6-АПК является не свободная фенилуксусная кислота, а фенилацетилглицин. При этом происходит переацилирование с отщеплением гликокола и образованием бензилпенициллина. Заменяя фенилуксусную кислоту на некоторые другие карбоновые кислоты, можно получить пенициллин с соответствующими радикалами.