Было бы удивительно, если бы в метод охлаждения, созданный эмпирическим путем, нельзя было внести никаких усовершенствований.
В течение нескольких лет, однако, общее мнение сводилось к тому, что вполне удовлетворительных результатов по переживанию сперматозоидов можно добиться, охлаждая обработанную глицерином бычью сперму со скоростью 1—2° в 1 мин от 0 до —15° и со скоростью 5° в 1 мин от —15 до —79°, но что можно применять и несколько ускоренные темпы охлаждения без какого-либо вреда для проб. Затем в 1955 г. Люйет и Кин сообщили, что 75% сперматозоидов выживало в пробах спермы, быстро охлажденных до температуры —27° и затем сразу же помещенных в жидкий азот с температурой —196°.
Сперму разбавили цитратом натрия, яичным желтком и 7% глицерина. Приблизительно спустя 24 час смесь разлили порциями по 0,2 мл в пробирки диаметром 9 мм. Затем сперму заморозили, быстро погрузив закупоренные пробирки в спиртовые охлаждающиеся смеси с температурой от —20 до —50°. Спустя 5 мин пробирки переместили в жидкий азот (—196°). В тех случаях, когда температура первого этапа охлаждения была —20°, сперматозоиды совершенно не ожили. По мере снижения температуры на первом этапе охлаждения процент переживших сперматозоидов постепенно увеличивался и, наконец, при температуре —27° выживало 75% сперматозоидов. Авторы пришли к выводу, что —27° и есть та критическая температура, при которой сперматозоиды особенно чувствительны к чрезмерно быстрому охлаждению.
Приведенные результаты были подтверждены Полджем, который показал, что они соответствуют его более ранним наблюдениям. Полдж считает, что большая часть бычьих сперматозоидов, взвешенных в соответствующей смеси глицерина, яичного желтка и цитрата натрия, переживает резкое охлаждение сначала от 0 или +5 до —20° и затем до —79°. В то же время они не переживают быстрого охлаждения от —20 до —196° или от —15 до —79°. Когда ампулы перемещали из среды с температурой —15° в ванну с температурой —79°, они охлаждались со скоростью 1—2° в 1 сек. Сперматозоиды не переносили такого быстрого охлаждения при температуре от —15 до —20°. Опыты Полджа показывают также, что обработанные глицерином сперматозоиды быка переживают охлаждение со скоростью 15° в 1 сек при температуре ниже —30°, тогда как в пределах от —20 до —30° такая скорость охлаждения вызывает тяжелые повреждения клеток. Они переносят охлаждение со скоростью 1—2° в 1 сек от —20 и до —30°, но повреждаются при охлаждении с данной скоростью от —15 до —20°. Когда ампулу со сперматозоидами быка, взвешенными при температуре +5° в среде, содержащей глицерин, перемещают в ванну с температурой —27 или —30°, содержимое ее вначале быстро охлаждается, но в интервале температур от —15 до —20° скорость охлаждения составляет 0,25—0,5° в 1 сек, а между —20 и —30° немного ниже. Сперматозоиды переносят охлаждение с такой скоростью в этом интервале температур. Когда ампулу перемещают из среды с температурой —30° в ванну, температура которой достигает —196°, ее содержимое охлаждается со скоростью около 15° в 1 сек, т. е. со скоростью, приемлемой для сперматозоида в данной температурной зоне. Интересно, что интервал температур, в пределах которого сперматозоиды, по-видимому, особенно подвержены температурному шоку, точно соответствует температурной зоне, в которой наступает больше всего повреждений при продолжительном пребывании сперматозоидов в концентрированных солях. Сперматозоиды, охлажденные в два приема (по Люйету), не теряют подвижности после оттаивания, поскольку они не испытывают температурного шока в критической зоне ниже —30°. Кроме того, они не страдают от физико-химического воздействия концентрированных солей во время пребывания в критической температурной зоне от —15 до —25°. Около 500 коров осеменили спермой, замороженной по двухступенчатому методу Люйета. Частота случаев успешного оплодотворения по существу не отличалась от той, которую можно было ожидать при использовании спермы, замороженной согласно общепринятому методу. Полдж, однако, настаивает на проведении опытов в широком масштабе (на тысячах коров) для выявления различий в оплодотворяющей способности спермы, обработанной различными способами. Возможный недостаток более быстрого двухступенчатого метода заключается в том, что охлаждение трудно осуществить с необходимой точностью. Между тем ошибки, допустимые в отдельных опытах, могут иметь очень тяжелые последствия при массовом применении этого метода.