Действие холода на яйца млекопитающих стали исследовать позже из-за методических трудностей, связанных с получением самих яиц и проверкой их жизнеспособности.
Хип в 1890 г. впервые успешно перенес оплодотворенные яйца от одного животного к другому. Он взял из половых путей одной крольчихи яйца на стадии 4 клеток и ввел их в половые пути другой крольчихи, где они развивались до тех пор, пока в положенный срок не наступили роды. Родившиеся два нормальных крольчонка были выращены своей «приемной матерью». Прошло семь лет, прежде чем Хипу удалось повторить свой результат, а спустя еще 40 лет этот результат был подтвержден рядом авторов. С тех пор яйца из половых путей одной самки в половые пути другой пересаживали не только у кроликов, но также у крыс, мышей, коров и овец. В некоторых опытах использовали неоплодотворенные яйца, взятые из фолликулов яичника или из фаллопиевых труб у животных, у которых вызывали овуляцию, вводя в соответствующем количестве гипофизарные вытяжки, содержащие гонадотропные гормоны. Эти яйца были оплодотворены после трансплантации в результате спаривания реципиента. В других опытах яйца еще до взятия их у донора были оплодотворены и начали делиться. Оплодотворенные яйца обычно вводят животному того же вида, что и донор. Однако проводили опыты с имплантацией яиц овцы в яйцеводы крольчихи, где они нормально дробились в течение нескольких дней. Во всех этих опытах яйца имплантировали в половые пути реципиента после кратковременного охлаждения их in vitro до низких температур.
Проблема хранения неоплодотворенных яиц млекопитающих in vitro осложняется тем, что они в течение лишь короткого периода времени сохраняют способность оплодотворяться. У некоторых видов быстро наступает партеногенетическое развитие яиц: 65% неоплодотворённых яиц кролика, взятых из фаллопиевых труб, при культивировании in vitro дробятся и внешне не отличаются от оплодотворенных. Однако они развиваются партеногенетически лишь до стадии морулы и, будучи введенными в половой тракт реципиента, не вызывают беременности. Неоплодотворенные яйца кроликов, крыс и овец, взятые из фаллопиевых труб, при охлаждении особенно подвержены активации. Тибо показал, что даже незначительное снижение температуры (на 4°) может активировать часть яиц и лишить их способности к оплодотворению, даже если единственное заметное морфологическое изменение заключается в выделении полярного тельца или перемещении ядерного веретена на ранней стадии вторичного дробления. Неоплодотворенные яйца крысы или кролика, не подвергшиеся активации, вскоре после овуляции, если их оставляют in situ, претерпевают выраженную дегенеративную фрагментацию. Когда неоплодотворенные яйца кролика, хранившиеся in vitro в течение 6—30 час при 0 или +10°, вводили реципиентам, которых затем спаривали, число нормально развивающихся яиц снижалось до 3—11%. Все приведенные факты показывают трудности, связанные с хранением in vitro неоплодотворенных яиц млекопитающих, поскольку малейшие изменения в них отражаются на последующем оплодотворении и нормальном развитии.
Яйца некоторых видов млекопитающих после оплодотворения становятся более устойчивыми. Если их выдерживать в соответствующей среде с нормальной температурой тела, они продолжают дробиться до стадии многоклеточной морулы. При понижении температуры дробление прекращается. Оптимальная температура хранения in vitro оплодотворенных яиц кролика, находящихся на стадии 2 клеток, была 10°, судя по проценту нормально развивающихся яйцеклеток, культивированных при температуре +37°. К сожалению, яйца, которые, по-видимому, нормально дробились в культурах, не всегда продолжали развиваться при трансплантации их другим кроликам. Дальнейшие исследования показали, что свежеоплодотворенные яйца лучше развивались in vivo, чем более старые, независимо от способа их трансплантации — свежими, после культивирования при +38° или после хранения в условиях низких температур. Например, когда яйца брали спустя 25 и 96 час после оплодотворения и перед трансплантацией их в половые пути самок-реципиентов хранили в течение 24 час при температуре +10°, в первом случае нормально развивалось 37%, а во втором — только 19%. Оптимальная температура хранения оплодотворенных яиц, которые затем имплантировали, составляла +10°. При трансплантации в фаллопиевы трубы после хранения в течение четырех дней при температуре +10° нормальное развитие наблюдалось только у 15% яиц. При хранении более 7 дней при +10° не было ни одного случая выживания или нормального развития яиц, имплантированных в матку. Оплодотворенные яйца не переживали быстрого или медленного замораживания при —65°, будучи взвешенными в лошадиной сыворотке или в сыворотке, содержащей 0,5—1% фруктозы. Как оплодотворенные, так и неоплодотворенные яйцеклетки кролика не дробились in vitro после охлаждении до —76° в обычной среде.
Положительные результаты осеменения млекопитающих и птиц сперматозоидами, хранившимися при низких температурах в средах, содержащих глицерин, вызвали дальнейшие поиски эффективных способов продолжительного хранения яиц млекопитающих в замороженном состоянии. Когда свежеоплодотворенные одноклеточные яйца кролика помещали в сыворотку, содержащую 15% глицерина, при температуре +20°, они сморщивались и больше не расправлялись независимо от того, оставляли ли их в 15-процентном растворе глицерина при комнатной температуре, в холодильнике с температурой +5° или в инкубаторе с температурой +38°. Не восстанавливались они также и в тех случаях, когда их перемещали в среду, лишенную глицерина. Следовательно, можно предполагать, что глицерин не проникал в клетки и они обезвоживались благодаря гипертоничности среды. Когда при температуре +37° концентрацию глицерина в сыворотке постепенно повышали и оплодотворенные яйца последовательно подвергали воздействию различных концентраций глицерина (2,5, 3,75, 5, 7,5, 10 и, наконец, 15%), яйца слегка сжимались, а затем на каждом этапе вновь расширялись. После постепенного удаления глицерина при +37° некоторые яйца разделялись в присутствии 3,75 и 2,5% глицерина, а остальные, помещенные в сыворотку, дробились и продолжали развиваться в течение дальнейших 24—48 час, пока не образовались морулы. Следовательно, кратковременное воздействие высоких концентраций глицерина не обязательно повреждало оплодотворенные яйца. Однако они отличались от сперматозоидов млекопитающих тем, что лучше переносили добавление глицерина при температуре тела, чем при более низкой температуре.
Оплодотворенные яйца кроликов, обработанные глицерином при +37°, охлаждали и хранили при разной температуре в течение различных периодов времени. Затем их согревали до +37° и перед посевом постепенно удаляли глицерин. В некоторых пробирках, содержащих яйца, взвешенные в сыворотке с примесью 15% глицерина, среду переохлаждали до —15°. Через 1 час обнаружили 75% жизнеспособных яиц, спустя день — 67%, а через 3 дня — 69% яиц. Через 4 дня при температуре —15° все оставшиеся пробы кристаллизовались и только 10% яиц начинали дробиться после оттаивания, удаления глицерина и посева. В пробирках с непереохлажденной средой выживало 10—30% яиц после замораживания на 1 час при температуре —17 и —20°. Полученные результаты показали, что состояние переохлаждения было недостаточно устойчивым для продолжительного хранения яиц в условиях низких температур. Несмотря на присутствие глицерина, яйца не переживали хранения в замороженном состоянии в обычной морозильной камере. Партии обработанных глицерином яиц охлаждали также до —79, —160 или —190°, а затем быстро согревали до +40°. Во всех яйцах, перенесших быстрое охлаждение и замораживание при низких температурах, тотчас же после оттаивания были обнаружены разрывы или другие явные признаки дегенерации. Во многих случаях медленно замороженные яйца выглядели нормальными после оттаивания, но дегенерировали во время удаления глицерина. Из 600 обработанных глицерином яиц, охлажденных до —79, —160 или —190° и затем согретых, только 6 дробились при посеве после удаления глицерина. Полученные результаты показывают, что воздействие глицерина и очень низких температур не всегда исключает возможность дальнейшего развития яиц млекопитающих. Однако для того, чтобы добиться выживания возможно большего их числа после такого хранения, необходимо выработать специальную методику. В настоящее время мы еще не владеем удовлетворительной методикой хранения яиц кролика в замороженном состоянии.
Яйца различных видов животных по-разному реагируют на одни и те же условия опыта. Так, яйца мыши труднее поддаются культивированию in vitro и трансплантации от одного животного другому, чем яйца кролика. Раннер и Палм разработали специальную методику для получения иеоплодотворепных яиц у неполовозрелых мышей и введения их в половые пути генетически отличающихся мышеи, которых затем спаривали. Они нашли, что вероятность выживания трансплантированных яиц достигала 14%. Несколько видоизменив эту методику, Лин и др. добились 17% выживаемости трансплантированных яиц мыши. Когда же в среду добавляли 7—10% глицерина, у «приемных матерей» развивалось лишь около 3% яиц. Попытки удалить глицерин перед трансплантацией не дали повышения выживаемости яиц. Когда неоплодотворенные яйца мыши помещали в среду, содержащую 5% глицерина, при +5°, они заметно сморщивались, так же как и яйца кролика в аналогичных условиях. Яйца мышей не расправлялись в течение 1,5 час при температуре +5°; следовательно, они, по-видимому, обезвоживались и глицерин не проникал внутрь яйца. Тем не менее до 22,8% таких яиц переживали трансплантацию. В более поздних опытах неоплодотворенные яйца мыши, взвешенные в модифицированном растворе Локка с примесью 5% глицерина, переохлаждали и выдерживали различное время при —10°. После воздействия указанной температуры в течение 30 мин нормально развивалось 17% трансплантированных яиц, после воздействия в течение 2 час — 5% яиц, а после воздействия в течение 6 час погибали все яйца. Интересно отметить, что неоплодотворенные яйца мыши, находившиеся в 5-процентпом растворе глицерина при 37°, вначале сжимались, а затем расправлялись, подобно оплодотворенным яйцам кролика. По-видимому, глицерин проникал внутрь яиц. Яйца мыши, инкубированные в течение 15 мин в среде, содержащей 5% глицерина, при трансплантации дали в 14% нормальные плоды. Следовательно, наличие глицерина внутри неоплодотворенных яиц не препятствовало их оплодотворению и последующему нормальному развитию. Затем Шерман и Лин установили, что неоплодотворенные яйца мыши переносят образование внеклеточных кристаллов льда при —10° и даже при —20° при условии непродолжительного периода хранения. Большая часть яиц разрушается при образовании внутриклеточных кристаллов, но, возможно, какая-то их часть и выживает. Шерман и Лип высказывают удивление по поводу кратковременной продолжительности жизни неоплодотворенных яиц мыши, законсервированных при пониженных температурах. Так, из нескольких сотен яиц, хранившихся в течение 24 час при температуре +5°, только 2 продолжали развиваться in vivo. Они быстрее разрушались при 0 или —10°. Не было обнаружено никаких структурных изменений в неоплодотворенных яйцах мыши, обработанных 25—35-процентным раствором глицерина при 5° и быстро охлажденных до температуры жидкого азота в висячей капле на покровном стекле или же в микроскопически малом объеме среды в ампуле. Данные о трансплантации яиц мыши после охлаждения до —196° пока еще не получены.
Методика трансплантации яиц млекопитающих от одного животного другому открывает огромные перспективы для исследований в области физиологии размножения, генетики и животноводства. Она не находит пока широкого применения из-за отсутствия надежного метода хранения in vitro в течение продолжительного периода времени оплодотворенных или неоплодотворенных яиц. Использование глицерина и низких температур не принесло практического решения настоящей задачи, хотя установлено, что глицерин не является летальным для свежеоплодотворенных яиц в критической фазе между сингамией и дроблением или же для неоплодотворенных яиц при воздействии на них в течение коротких периодов времени при температуре, близкой к нулю.