Повышенный интерес к вопросу о возможности консервации простейших в замороженном состоянии при низкой температуре вызвало сообщение Когшолла, что малярийные плазмодии в инфицированной крови сохраняли жизнеспособность и вирулентность и после хранения их при температуре —76°.
Кровь брали у обезьян макаков-резусов с подострой или хронической инфекцией Plasmodium knowlesi и P. inut. В некоторых пробах кровь перед замораживанием свертывалась, а в других ее либо подвергали дефибринированию, либо добавляли гепарин или цитрат. Несвернувшуюся кровь разливали по 1 мл в целлулоидные пробирки (приблизительно 12х2 см). Пробирки погружали в охлаждающую смесь спирта и CO2 с температурой —79° и вращали до тех пор, пока кровь не образовывала на внутренних стенках пробирки пленку и быстро не замерзала. Затем пробы выдерживали некоторое время при —76°, после чего их быстро оттаивали, погрузив в водяную баню с температурой 37,5°. Пробы крови подвергали анализу для определения числа неповрежденных эритроцитов и плазмодиев, а затем вводили здоровым макакам-резусам. Пробы зараженной крови, хранившиеся в течение 19—70 дней при температуре —76°, вызывали у животных малярию. В трех случаях концентрация плазмодиев в каждой пробе до замораживания была меньше 1 на 10000 эритроцитов. Инкубационный период болезни, вызванной введением крови, подвергавшейся замораживанию, почти не отличался от инкубационного периода у обезьян, которым вводили свежую инфицированную кровь. Следовательно, несмотря на то что во время замораживания и оттаивания лишь незначительное число эритроцитов не гемолизировалось, кровь почти полностью сохранила вирулентность. Исследования Когшолла показали применимость метода консервации в замороженном состоянии для сохранения жизнеспособности малярийных плазмодиев и других патогенных простейших in vitro. Этот метод, возможно, вытеснит те обычные методы поддержания чистоты различных штаммов микроорганизмов, которые трудоемки, дороги, небезопасны и связаны с необходимостью пересевов или прививок животным.
Методику Когшолла с некоторыми модификациями использовали Аркетти для хранения P. gallinaceum, а также Мэнуэлл и сотрудники, которые выдерживали малярийных плазмодиев в инфицированной птичьей крови в замороженном состоянии при температуре от —55 до —78°. После оттаивания эти плазмодии вызывали болезнь у канареек. Обработанный таким способом P. lophurae после оттаивания сохранял свою инфекционность (в опытах на утках). Мэнуэлл отметил, что если бы эффективность хранения крови определяли по степени ее способности передавать инфекцию, то метод хранения ее в замороженном состоянии можно было бы считать на 100% эффективным. Однако соотношение паразитов и выживших эритроцитов или же соотношение неповрежденных клеток и разрушенных, определенное на окрашенных мазках, показывает, что этот метод оставляет желать лучшего. Мэнуэлл и Эджет установили, что повышение скорости замораживания и оттаивания путем использования более узких пробирок и механического вращения их во время охлаждения и согревания увеличивало соотношение восстановленных здоровых и зараженных эритроцитов. В результате замораживания при —10, —30 или —55° с последующим хранением при —75° погибало больше эритроцитов, чем в результате замораживания при температуре твердой углекислоты. Ни одна из проб крови, хранившихся при —10° в течение сравнительно коротких промежутков времени, после оттаивания не вызывала заболевания при введении. В противоположность этому не получено никаких данных о повышении процента гибели среди простейших, хранившихся в течение 244 дней при температуре —75°.
Уолфсон изучала на утках вирулентность малярийных плазмодиев P. lophurae, P. cathemerium и Р. relictum, хранившихся в замороженном состоянии при низких температурах. Она обнаружила, что соотношение эритроцитов и плазмодиев, переживших хранение, находилось в прямой зависимости от содержания инфицированных эритроцитов в пробе крови до замораживания. Ни промежуток времени между прививкой и появлением плазмодиев в кровяном русле, ни степень тяжести инфекции не изменялись, когда утке вводили инфицированную кровь, хранившуюся от 2 дней до 1 года при температуре —75°. Саундерсу и Скотту первым удалось законсервировать P. vivax в замороженном состоянии при —76° в человеческой крови и показать, что после оттаивания кровь сохраняла вирулентность и ее можно было использовать для пиротерапии нейросифилиса.
Больших успехов добились Уэйнмэн и Мак-Аллистер, которые установили, что в тех случаях, когда культуры или инфицированную кровь перед хранением при —70° замораживали при —15°, процент выживших микроорганизмов после оттаивания был выше, чем в пробах того же материала, сразу замороженных при —70°. Таким образом, впервые было показано, что медленное охлаждение, возможно, действует на простейшие менее разрушительно, чем быстрое замораживание при температуре ниже нуля. Трипаносомы четырех различных видов, замороженные в два приема, переживали хранение при —70° в течение 19 месяцев. После оттаивания часть микроорганизмов сохранила подвижность; из них были получены вирулентные культуры, и животные, которым их вводили, заболели. Leishmania tropica и L. donovani хранили таким образом в течение различных периодов времени (до 2 лет). Когда культуру Trichomonas hominis замораживали при —70° и затем оттаивали, все микроорганизмы погибали. Будучи же предварительно замороженными при —15°, они переживали последующее хранение при —70° в течение 5—407 дней. Труднее было консервировать Т. vaginalis. Только в двух пробах из десяти, замороженных при —15° и хранившихся при температуре —70°, после оттаивания были обнаружены живые микроорганизмы. Любопытные результаты были получены в опытах с Toxoplasma gondii. Несмотря на то, что эти микроорганизмы пережили замораживание при —70° и последующее оттаивание, все они погибли во время продолжительного хранения при указанной температуре. Аналогичные данные получили Мэнуэлл и сотрудники, которые впервые высказали предположение о том, что простейшие могут погибать во время храпения при низких температурах. Попытки консервировать. Entamoeba histolytica при —70° также потерпели неудачу, хотя в одном случае в культуре, выдерживавшейся при —15°, были обнаружены жизнеспособные организмы.
Левадити установил, что выживаемость Trypanosoma congolense или Plasmodium berghei в мышиной крови, хранившейся при —70°, зависела, по крайней мере частично, от содержания инфицированных, но не поврежденных эритроцитов. При медленном замораживании и оттаивании проб крови наступал выраженный гемолиз, и плазмодии плохо выживали. Пробы крови, быстро охлажденные, хранившиеся 15—100 дней при —70°, а затем быстро оттаянные, содержали достаточное количество инфицированных интактных эритроцитов, чтобы вызвать заболевание у мышей. Исследование под микроскопом показало, что около 20% трипаносом сохранили подвижность; с точки зрения морфологии многие микроорганизмы выглядели также нормальными, хотя у части малярийных плазмодиев (P. berghei) наблюдался лизис. В настоящее время выяснено, что уменьшение числа живых малярийных плазмодиев в медленно охлажденных инфицированных пробах крови, отмеченное Мэнуэллом и сотрудниками, обусловлено усилением гемолиза. Уэйнмэн и Мак-Аллистер добились хороших результатов при медленном охлаждении простейших по той причине, что эти микроорганизмы не относились к паразитам, жизненный цикл которых связан с пребыванием в эритроцитах.