Выше было показано, что на основании многих и разносторонних исследований глиадин нельзя считать гомогенным, химически индивидуальным белковым веществом. Возникает вопрос, является ли глиадин смесью нескольких гомогенных белков или его макромолекула состоит из однородных субмолекул, способных в зависимости от внешних условий ассоциироваться в различных комбинациях, образуя «глиадины», отличающиеся друг от друга молекулярным весом и другими физико-химическими свойствами. Определенного ответа на этот вопрос пока нет, однако имеющиеся в литературе данные позволяют высказать некоторые соображения о возможной природе глиадина. В недавно опубликованной работе Холм и Бриггс (Holme, Briggs, 1959) попытались подойти к выяснению физической природы глиадина путем анализа его растворимости и электрофоретических свойств получаемых растворов.
Указанные авторы считают, что нерастворимость глиадина в чистой воде при нейтральной реакции зависит от сильного взаимодействия между молекулами глиадина, препятствующего переходу их в раствор, несмотря на большую способность к гидратации. Это взаимодействие обусловлено, по мнению авторов, водородными связями между соседними молекулами глиадина. Вода обладает способностью к образованию водородных связей с другими веществами, однако конкуренция воды с межмолекулярными водородными связями глиадина, по-видимому, недостаточно сильна и потому глиадин в воде только набухает, но не растворяется. Если же подкислить воду, то при рН ниже 4,0 глиадин начинает переходить в раствор. Это обусловлено появлением на молекулах глиадина небобольших электрических зарядов, которые, будучи одноименными (положительными), способствуют ослаблению связи между соседними молекулами глиадина и последние начинают переходить в раствор. То же самое наблюдается при достаточном сдвиге реакции в щелочную сторону. Если же к кислому или щелочному раствору глиадина добавить немного нейтральной соли, увеличив ионную силу раствора до величины 0,05, то глиадин становится столь же нерастворимым, как и при нейтральной реакции. Ионы солей экранируют своими зарядами заряды белковых молекул, вследствие чего вновь восстанавливается исходное равновесие между белком и растворителем, при котором водородные межмолекулярные связи глиадина препятствуют переходу его в раствор. Предполагая, что высокое содержание амидных групп в глиадине может быть источником большого числа межмолекулярных водородных связей этого белка, Холм и Бриггс провели осторожное отщепление амидных групп с помощью слабого гидролиза глиадина по Виккери 0,008—0,04-нормальным раствором соляной кислоты. Пептидные связи белка при этом не были затронуты. Нейтрализованный после гидролиза раствор был диализован и белок выделен лиофилизацией. Отщепление 10—53% общего количества амидных групп белка сделало глиадин растворимым в воде при рН = 7,0 (и выше) и ионной силе 0,10, что указывает на явное ослабление межмолекулярных сил, препятствовавших ранее переходу белка в раствор. В то же время при рН = 3,8 и ионной силе 0,01 глиадии стал нерастворимым вследствие сдвига его изоэлектрической точки в кислую сторону, благодаря частичной замене амидных групп (CONH2) карбоксильными (СООН). Это обстоятельство, наряду с уменьшением числа водородных связей, сыграло, несомненно, роль и в повышении растворимости глиадина при нейтральной и щелочной реакциях, так как прямые электрофоретические измерения показали, что частицы деамидированного глиадина заряжены отрицательно.
Для того чтобы перевести естественный глиадин в раствор при нейтральной реакции, необходимо применить растворитель, обладающий высокой способностью к образованию водородных связей с молекулами глиадина. Таким растворителем является, например мочевина, добавление которой к суспензии глиадина в воде (1—2 моля и выше) приводит к полному растворению белка. При этом те участки глиадиновых молекул, которые способны к образованию водородных связей, образуют их теперь с мочевиной, а не с соседними молекулами глиадина, что и приводит к диспергированию Глиадина, нарушению его межмолекулярных связей и переходу вследствие этого в раствор.
Действие мочевины так сильно, что ее 2-молярная концентрация обеспечивает растворение глиадина даже при высокой ионной силе раствора, когда электрические заряды белковых молекул полностью экранированы ионами соли. Это может быть иллюстрировано следующими данными Холма и Бриггса, измерявшими мутность 1%-ного раствора глиадина в воде с добавлением НСl до рН = 3,6 при разной ионной силе раствора, создаваемой изменением концентрации NaCl, в присутствии 2 М мочевины и без нее.
Рисунок показывает, что растворимость глиадина в подкисленной воде быстро снижается при повышении ионной силы до 0,02, тогда как в присутствии мочевины она остается неизменной в широком диапазоне ионной силы раствора.
Электрофоретйческие исследования, проведенные Холмом и Бриггсом с растворами глиадина в мочевине, показали, что глиадин не является гомогенным белком, но состоит не менее чем из трех электрофоретически различимых фракций. Измерение молекулярных весов глиадина и его фракций, полученных по Хаугаарду и Джонсону (Haugaard, Johnson, 1930), было выполнено авторами с помощью методов седиментации (в ультрацентрифуге) и светорассеяния. Оказалось, что 90% исходного глиадина составляет компонент, гомогенный при ультрацентрифугировании, с молекулярным весом около 24 000. Гомогенность этого компонента, полученного в небольшом количестве в очищенном состоянии, не была, к сожалению, электрофоретически. Остальные 10% веса исходного глиадина состоят из гетерогенной смеси белков, чая, по-видимому, липопротеин.
Подробно изложенные нами результаты исследований Холма и Бриггса проливают свет на физическую природу растворимости глиадина, но мало освещают вопрос о причинах гетерогенности этого белка. Приходится констатировать, что молекулы или агрегаты молекул глиадина, находящиеся в растворе, не являются идентичными. Вероятно, в зависимости от условий растворения, характера растворителя, рН, температуры и т. д. молекулы глиадина могут в той или иной степени ассоциироваться или, наоборот, диссоциировать, образуя в каждом случае некоторую равновесную систему из определенного числа неодинаковых компонентов.
В этом отношении возможна аналогия между глиадином и некоторыми другими растительными белками. Так, например, В. JI. Кретович, Т. И. Смирнова и С. Я. Френкель (1958) в результате подробного исследования современными физико- химическими методами глобулина сои — глицинина доказали, что макромолекулы этого белка состоят из идентичных субмолекул, образующих за счет сил Ван-дер-Ваальса устойчивый гексамер или другие менее устойчивые ассоциации.
Каждая субмолекула имеет молекулярный вес около 20 ООО, а гексамер (состоящий из 6 субмолекул)— 126 000.
Макромолекулы гексамера способны к дальнейшей обратимой ассоциации за счет преимущественно электростатических сил. В зависимости от внешних условий и прежде всего от реакции среды могут существовать различные равновесные системы, состоящие из субмолекул, гексамера и других модификаций глицинина, что приводит к широкому варьированию величин молекулярных весов, электрофоретических характеристик и других физико-химических показателей фракций этого белка. Вероятно, подобные соотношения характерны не только для глицинина, но и для многих других белков. В отношении глиадина пшеницы нет прямых доказательств построения его макромолекул из определенных идентичных субмолекул, однако все описанные выше данные по фракционированию глиадина в разных условиях и его гетерогенности в отношении молекулярного веса, электрических свойств и т. д. позволяют считать такое представление принципиально возможным. Фактическое выяснение природы и строения глиадина является важной и плодотворной задачей будущих исследований.