Вышеприведенные данные о скрытом бруцеллоносительстве указывают на трудности дифференциации скрытых бруцеллоносителей как в первой фазе, когда у животного не было еще ни генерализации инфекции, ни клинических признаков болезни, так и в третьей фазе, когда возникает хроническое течение болезни у животных, перенесших генерализованный процесс.
Если в первой фазе и в начале генерализации животные не имеют иммунитета против бруцеллеза, то в конце второй фазы, когда бруцеллы исчезают из крови, уже воспроизводится иммунное состояние. Однако иммунитет возникает при бруцеллезе лишь относительный, а у некоторых животных нестерильный. Поэтому такой иммунитет, не производится дифференциация действительно выздоровевших и освободившихся от инфекции животных от хронически больных, практически не может служить критерием благополучия стада. Вместе с тем приведенные данные свидетельствуют о несовершенстве существующих способов диагностики скрытых форм бруцеллеза.
Следовательно, при проведении противобруцеллезных мероприятий возникает необходимость пользоваться не только данными обследования животных по РА и РСК (РДСК), но и эпизоотологическим анализом. Так, например, если телки находились на неблагополучной ферме по бруцеллезу хотя бы в течение нескольких месяцев, они должны быть под наблюдением как неблагополучные по бруцеллезу, то крайней мере, до первого отела по всей группе, независимо от того, сколько раз их исследовали указанными серологическими методами: отрицательным результатом по всей группе. Такое же отношение должно быть и ко взрослым животным, которые находились в активных очагах инфекции, с той разницей, что в этих случаях нормальные по всей группе не могут служить критерием благополучия стада, так как часть коров при нормальных отелах может выделять возбудителя с молоком в период лактации.
В связи с изложенным возникает необходимость изыскания способов дифференциации антител, воспроизводимых животными, больший естественным бруцеллезом, от антител, возникающих после вакцинации, а также выявления в стадах скрытых бруцеллоносителей, не реагирующих на бруцеллез.
Анализ результатов проведенных нами, опытов, а также литературных данных показывает, что для выявления скрытого бруцеллоносительства вполне приемлем метод провокации с использованием живых вакцин в качестве специфического провоцирующего препарата.
Следует отметить, что провокация бруцеллезной инфекции насту — 1ает и от применения неспецифических биологических препаратов. Гак, например, Ф. П. Локтева (1965) сообщает о появлении положительных показаний по РСК и по РА в титре до 1 : 200 у животных, неблагополучных по бруцеллезу и привитых вакциной из штамма № 19, после введения им вакцин против сибирской язвы, щура. Кроме того, ею отмечено повышение титров в реакции агглютинации в период отелов у коров из неблагополучных стад, вакцинированных вакциной из штамма № 19.
П. А. Триленко с соавторами (1973) наблюдали появление противобруцеллезных антител в организме 5-летних коров, ранее привитых 1 годичном возрасте вакциной из штамма № 19, после введения им противоящурной вакцины. В данном случае провокация признаков бруцеллеза характеризовалась тем, что после введения противоящурной вакцины у 30% коров были положительные и сомнительные показатели по РСК и у 10% — преимущественно сомнительные показазатели по РА, тогда как до вакцинации все животные реагировали отрицательно.
Однако результаты иммунологических сдвигов у животных, хронически больных бруцеллезом и являющихся бруцеллоносителями, могут быть точно учтены только тогда, когда провокация осуществляется препаратом, не обладающим такой же антигенностью, какой обладает возбудитель болезни (патогенные бруцеллы).
Более совершенным препаратом для выявления скрытых бруцеллоносителей в стадах являются живые культуры, полученные из штаммов бруцелл в МВБ-форме. При подкожном введении культур бруцелл в МВБ-форме не появляются в крови S-антитела, что дает возможность изучить динамику S-антител у провоцируемых бруцеллоносителей. В то же время живые бруцеллы в МВБ-форме, проникнув в кровь и во внутренние органы животных, вызывают специфическое суперинфицирование организма бруцеллоносителей.
Как известно, специфическая суперинфекция является самым активным стимулятором дремлющей инфекции. Положительный эффект провокации определяют по заметному увеличению в крови животных бруцеллоносителей количества бруцеллезных S-антител, которые никогда не возникают у взрослых животных, прививаемых вакцинами из штаммов бруцелл в МВБ-форме.
Необходимо подчеркнуть еще одну важную особенность провокации методом введения больших доз указанных выше вакцин: вакцины из штаммов бруцелл в МВБ-форме обладают О-антигеном бруцелл, иммунологически идентичных О-антигену эпизоотических штаммов бруцелл, что и определяет специфичность провокации.
При введении вакцины животным, бруцеллезный процесс у которых в фазе первичной или вторичной латенции, в результате суперинфицирования активизируется естественная инфекция, имеющаяся в организме бруцеллохроников, вследствие чего появляются в крови бруцеллезные S — и О-антитела. По наличию указанных антител в крови можно отличить больных животных от здоровых путем исследования их крови по РА и РСК (РДСК) со стандартными антигенами. Как уже указывалось выше, в данном случае положительные показатели реакции будут только у больных бруцеллезом животных, так как со стандартными антигенами в обеих реакциях обнаруживаются только S-антитела. Достоинством провокации латентных форм бруцеллеза вакциной из нереверсивных штаммов бруцелл является то, что после введения ее у неинфицированных животных вырабатывается достаточно высокий иммунитет, чтобы противостоять той инфекции, которая остается еще в бруцеллезных очагах.
Следовательно, сравнительно быстрому оздоровлению стад от бруцеллеза при использовании вакцины из штаммов бруцелл в МВБ-форме способствует, с одной стороны, то, что животные при этом приобретают иммунитет, с другой, то, что в оздоравливаемых стадах резко уменьшается возможность суперинфицирования привитых животных в результате ликвидации источников эндогенной инфекции.
Широкое и разностороннее исследование эффективности оздоровления стад крупного рогатого скота от бруцеллеза с применением вакцины из штаммов № 16 и 16/4 характеризовалось следующими показателями.
В стаде, неблагополучном по бруцеллезу в течение многих лет, были отобраны 42 коровы, не реагировавшие на бруцеллез при исследованиях в 1956, 1957, 1958, 1959 и 1960 гг. (до 1 июня). Однако ежегодно в нем имели место редкие аборты бруцеллезного происхождения; при каждом исследовании крови животных обнаруживались реагирующие на бруцеллез коровы.
В 1960 г. 42 отобранным животным было подкожно введено по 10 млрд. микробных тел живой культуры бруцелл в МВБ-форме из штамма № 16. Через 5 дней после инъекции реагировали по РА положительно 2 и сомнительно — 13 коров, по РДСК — положительно — 3 и сомнительно — 3 коровы. Однако при исследовании через 22 дня после провокации реагировала положительно только дна корова под кличкой Гроза. Через 35 дней эта корова дала такой же результат. Кроме нее, еще 3 коровы реагировали сомнительно. Таким образом, лишь одна корова из 42 вызывала подозрение о возможном бруцеллоносительстве или о том, что она освободилась от инфекции в непродолжительное время перед провокацией, та корова была убита для бактериологического обследования, культуры бруцелл выделены из лимфатических узлов головы и из внутренних органов.
Более широкий опыт был проведен на поголовье 8 групп крупного рогатого скота, неблагополучного по бруцеллезу.
Анализ данных показывает, что бычки телки, находившиеся на неблагополучных по бруцеллезу фермах ли в острых очагах бруцеллезной инфекции, заражаются бруцеллезом, но в отдельных случаях не реагируют на бруцеллез при исследовании сыворотки крови по РА и РСК. Эти животные могут проявить положительные или сомнительные реакции после введения им живой культуры бруцелл в МВБ-форме, не вызывающих диагностируемых — антител, но стимулирующих их образование у зараженных животных. Кроме того, данные табл. 32 показывают, что процент реагирующих после провокации у телят старшего возраста несколько выше, чем телят младшего возраста. Эти колебания в проведенных выше опытах составляют от 2—3 до 7—10%.
Провокация S-антител происходит также у животных, привитых вакциной из штамма № 19. Наблюдениями установлено, что среди здоровых взрослых животных, привитых вакциной из штамма № 19, через 2—3,5 года после прививки могут еще обнаруживаться реагирующие на бруцеллез по РА и РСК. Важно отметить, что в очагах затухающим бруцеллезом реактивность животных, ранее привитых вакциной из штамма № 19, на введение культуры бруцелл в МВБ-форме не всегда проявляется, а если и бывает, то у единичных животных. Это видно из приводимых ниже материалов по применению указанной культуры для обработки животных двух неблагополучных пи бруцеллезу стад.
В одном из указанных стад неблагополучие по бруцеллезу возникло в послевоенные годы. В стаде имелось 143 коровы, все реагирующие на бруцеллез животные были удалены, не реагирующие поставлены на первый контроль.
При последующих серологических обследованиях стали обнаруживаться в стаде реагирующие по РА и РСК животные. Кроме того, пыли зарегистрированы аборты бруцеллезного происхождения. Все это побудило привить животных, включая молодняк с 6-8-месячного возраста, вакциной из штамма №19. Прививки всего взрослого поголовья были произведены 2 раза — в 1955 и 1956 гг. Воспроизводственных телок прививали вакциной из штамма № 19 в 5-12-месячном возрасте ежегодно с 1955 по 1962 г. включительно. По достижении случного возраста телок ревакцинировали. Аборты бруцеллезного происхождения в стаде после прививок были зарегистрированы в 1961 г. (2 случая), в 1962 и 1963 гг. (по 1 случаю). Бруцеллез в стаде диагностирован Ленинградской областной ветбаклабораторией на основании выделения культуры бруцелл из абортированных плодов.
Перед применением культуры бруцелл все животные указанного стада были обследованы на бруцеллез. Положительно реагирующих по РА и РСК оказалось 29 коров, которые сразу же были удалены из стада. Прививки культурой бруцелл из штамма № 16 были сделаны 97 коровам, нереагирующим на бруцеллез по РА и РСК. Культуру вводили подкожно по 80 млрд. микробных тел. Через 1 и 2 мес после прививок культурой этих животных обследовали по РА и РСК на бруцеллёз со стандартными (биофабричными) S-антигенами. Из указанного числа ни одна корова не реагировала ни положительно, ни сомнительно. В дальнейшем обследование животных этого стада на бруцеллез проводили теми же методами 2 раза в год. За 5 лет после введения культуры бруцелл в МВБ-форме реагирующих на бруцеллез или абортировавших на почве бруцеллеза в стаде зарегистрировано не было.
Второе стадо было неблагополучным по бруцеллезу крупного рогатого скота с 1945 г. Телят все время выращивали изолированно. Молодняк прививали вакциной из штамма № 19, начиная с 1952 г. До 1957 г. его вакцинировали в 6—8-месячном возрасте и ревакцинировали за 2—3 мес перед случкой. С 1957 по 1952 г. молодняк прививали однократно в 6—8-месячном возрасте. Бруцеллезная инфекция в стаде, начиная с 1956 г., постепенно угасала. Абортов бруцеллезною происхождения в 1961 и 1962 гг. не зарегистрировано. К началу опыта, в апреле 1963 г., на всех фермах выявлялись лишь единичные животные, реагирующие на бруцеллез. Так, в 1961 и 1962 гг. из 204 коров реагировало на бруцеллез по РА и РСК положительно только 6.
В апреле 1969 г. всем не реагировавшим на бруцеллез коровам подкожно введено по 70 млрд. микробных тел живой культуры бруцелл из штамма № 16. После прививок через 1 и 2 мес у животных была обследована кровь на бруцеллез, как это указано выше. Реагировала положительно по РА и РСК только одна корова. Последующие 5-летние наблюдения и исследования показали стойкое благополучие стада по бруцеллезу, так как за указанный срок не было зарегистрировано реагирующих на бруцеллез по РА или РСК и абортов бруцеллезной этнологии.
Однако совсем другие результаты были получены при изучении реактивности организма животных на подкожное введение той же культуры, но в период активного течения бруцеллеза в стаде.
Для подтверждения высказанного положения уместно привести результаты опыта, проведенного на трех неблагополучных по бруцеллезу фермах крупного рогатого скота, ранее вакцинированного вакциной из штамма № 19.
Ферма № 1 в течение ряда лет считалась неблагополучной по бруцеллезу. На ферму в 1958—1959 гг. ставились для зимовки нетели, полученные от бруцеллезных коров других ферм. Этим нетелям в 6—8-месячном возрасте сделана прививка вакциной из штамма № 19. В связи с тем, что среди нетелей возник клинический бруцеллез (аборты), ферма была замкнута. Реагирующих коров (нетелей) не удаляли с фермы, но изолировали в другие коровники на этой же ферме. На ферме имелось 90 коров, из них реагирующих на бруцеллез по РА или РСК или по обеим реакциям 41 корова и нереагирующих — 49. Нереагирующие коровы были использованы для опыта — обработаны культурой бруцелл из штамма № 16.
Ферма № 2 также была неблагополучной по бруцеллезу. В течение последних 5 лет на ферму стали поступать бруцеллезные животные из других ферм. Таким образом, эта ферма превратилась в бруцеллезный изолятор. В ней всех телок прививали в 6—8-месячном возрасте вакциной из штамма № 19. Перед опытом стадо было обследовано на бруцеллез по РА и РСК. Из 84 коров реагировали на бруцеллез 37. Остальные 47 коров были использованы для опыта.
Форма № 3 являлась старым, с послевоенных лет бруцеллезным изолятором, куда ежегодно вводили реагирующих на бруцеллез коров из других ферм. Большинству взрослых животных дважды были сделаны прививки вакциной из штамма № 19. В последующее время прививали только молодняк. В период проведения обследования из 78 коров не реагировали на бруцеллез 23 коровы, которые были взяты в опыт. Во всех фермах ежегодно имелись аборты бруцеллезной этиологии.
Коровы трех ферм, которые не реагировали на бруцеллез по РА и РСК со стандартными антигенами, перед обработкой живой культурой бруцелл из штамма № 16 были переведены из очагов инфекции в обособленный, специально подготовленный коровник. Здесь животных после обработки культурой обследовали на бруцеллез 2 раза с интервалом 1 и 2 мес. В очагах с активным течением бруцеллеза животные проявляют в большом проценте иммунологическую активность на введение живой культуры бруцелл. Если в очагах с затухающим бруцеллезом случаи активизации противобруцеллезных антител возникают крайне редко, то в очагах активной инфекции провокация антител бывает более чем у 1/3 животных, не реагировавших на бруцеллез перед опытом.
Естественно, возникает вопрос об инфицированности животных бруцеллами как тех, которые проявляют серологическую специфическую активность после обработки их культурой бруцелл из штамма №16, так и тех, которые не реагируют на введение культуры. Это особенно важно потому, что животные, проявляющие S-антитела после введения культуры, обязательно должны иметь в своем организме бруцеллы в S-форме, т. е. патогенные эпизоотические штаммы.
Безусловно, что коровы первой группы, т. е. реагирующие на бруцеллез по РА и РСК после введения в их организм МВБ-культуры, ряде случаев являются бруцеллоносителями. Для подтверждения сказанного нами с диагностической целью было убито 7 коров из этой группы. Культуры бруцелл удалось выделить от 2 коров.
Что касается коров второй группы, т. е. реагирующих на бруцеллез по РА и РСК после обработки их культурой бруцелл в МВБ-форме, mi следует полагать, что все они свободны от патогенных штаммов бруцелл. Достоверным показателем указанного предположения являются нормальные отелы у всех коров этой группы.
Кроме того, наблюдениями установлено, что среди коров второй группы в течение 6 лет не было абортов бруцеллезного происхождения и не выделялись положительно реагировавшие на бруцеллез in) ГА и РСК. Воспроизводство у всех коров группы было нормальное.
С целью проверки коров на бруцелловыделение в первый период после объединения их в самостоятельное стадо периодически брали в них молоко и исследовали на наличие бруцелл методом прямых посевов на плотный печеночный агар с генцианвиолетом (1 : 200000) и путем заражения отстоявшимися сливками морских свинок. Всего было взято 253 пробы молока. Заражали 18 морских свинок (групповая проба). Культуры бруцелл не были выделены ни методом прямых посевов, ни методом заражения морских свинок. Стадо осталось благополучным по бруцеллезу в течение нескольких лет до его ликвидации по причине физиологического износа. Молодняк (телки), нарождающийся от этих коров, не прививали.
Зарубежные исследователи, например Каннингэм и Коннор, также проводят изыскания методов выявления скрытых бруцеллоносителей, используя для этой цели особые антигенные свойства вакцины 45/20. Авторы обозначили убитую адъювант-вакцину так: К 45/20 А. Использованная ими методика исследования состояла в следующем. Было взято 53 неблагополучных стада крупного рогатого скота. Перед прививкой всех животных обследовали по РА, РСК и реакции Кумбса. Удаляли из стада только положительно реагирующих по двум реакциям — РА и РСК. Из 944 обследованных голов было удалено авторами 95. Всех беременных телок (нетелей) с 5-го месяца беременности изолировали до отела. После отела в стада возвращали только тех коров, которые не реагировали на бруцеллез. Через 6 нед после вакцинации вакциной К 45/20 А брали кровь и исследовали теми же методами, что и до прививки. Оценку результатов исследования проводили по специальной схеме. Реагирующих положительно по всем трем реакциям удаляли из стад, реагирующих сомнительно — оставляли. Эти исследования считались «анамнестическими». В дальнейшем животных, оставшихся в стадах, ревакцинировали той же вакциной. После ревакцинации их исследовали через каждые 1-2 мес только по РА и РСК, так как авторы считали, что титр по реакции Кумбса после двух вакцинаций будет очень высоким. В результате двукратных прививок вакциной К 45/20 А титры здоровых животных, как правило, не превышали 2/8 и имели тенденцию к снижению до отрицательного показателя. Коров, давших по РСК титр 4/16 или выше через 6 мес после ревакцинации, считали положительно реагирующими и удалили из стад.
Результат применения вакцины по указанной методике следующий, бруцеллезные аборты регистрировались в 39 стадах из 53 в течение месячного срока. Следовательно, 14 стад считалось «в стадии излечения» на том основании, что в 22-месячный срок в них аборты бруцеллезного происхождения не регистрировались, но реагирующие на бруцеллез животные выделялись.
Обоснованием для указанного опыта было то, что, по данным Каннингэма (1968), только один тип вакцины из штамма 45/20 дает постоянные серологические реакции. Эти показатели следующие. Через 6 нед после первой инъекции вакцины у благополучных по бруцеллезу животных РА и РСК должны оставаться отрицательными (РА 30 ME и РСК 2/2), а титр реакции Кумбса не должен превышать 4/40. После второй инъекции вакцины титр в реакции Кумбса может достигать до 1/160 и более, а в РСК — до 2/8. Титры в РА незначительные, но могут достигать сомнительной оценки (30 ME).