Сперма козла с концентрацией глицерина после разбавления 10—15% после медленного охлаждения до —79° по методике, применявшейся при охлаждении бычьей спермы, содержала весьма подвижные сперматозоиды.
В настоящее время, однако, получено еще мало данных относительно оплодотворяющей способности замороженной спермы козла. Возможно, это объясняется тем, что при разведении коз искусственное оплодотворение применяют сравнительно редко. Большой подвижностью отличаются сперматозоиды барана после охлаждения до —79° в средах, аналогичных тем, которые использовали для бычьей спермы, и содержащих 5—25% глицерина. Досадно, что оплодотворяющая способность спермы, несмотря на большую подвижность сперматозоидов, значительно снижается после оттаивания. В некоторых сериях опытов забеременело только 5% овец, осемененных замороженной спермой. В одном опыте из 2000 овец, осемененных замороженной спермой, забеременело 15—20%. В Советском Союзе были получены несколько лучшие результаты: после осеменения спермой, хранившейся в замороженном состоянии, беременность наступала у 15—33,5% овец. Примечательно, что между подвижностью сперматозоидов in vitro и оплодотворяющей способностью проб существует весьма слабая корреляция. Возможно, здесь имеет значение тот факт, что дыхание и гликолиз in vitro были сильно подавлены в пробах сперматозоидов барана, характеризовавшихся большой подвижностью и охлажденных до —79°; среда в этих пробах отличалась от обычно используемых отсутствием в ней яичного желтка и молока, а также применением фосфатных, а не цитратных буферов. Когда удастся выяснить причину такой «идиосинкразии» сперматозоидов барана, несомненно, будут внесены надлежащие изменения в состав среды и разработана специальная методика, способствующая сохранению полной функциональной способности спермы при низких температурах.
Сравнительно мало использовали искусственное оплодотворение при разведении лошадей, свиней, собак и других домашних животных. Тем не менее, имеются некоторые сведения относительно реакции на глицерин, а также о выживании сперматозоидов этих животных после воздействия низких температур. Так, большое число сперматозоидов жеребца не переживает замораживания, если всю сперму смешивают с содержащими глицерин разбавителями, применявшимися для разведения спермы быка. Когда сперматозоиды жеребца путем центрифугирования отделяли от плазмы семенной жидкости и взвешивали в среде с примесью глицерина, глюкозы и фосфатных буферов, только у 25% сперматозоидов после оттаивания восстанавливалась подвижность. Не удавалось добиться лучших результатов и в тех случаях, когда сперматозоиды жеребца взвешивали в среде, содержащей яичный желток и цитрат натрия. В то же время подвижность сперматозоидов до замораживания полностью сохранялась в средах, содержащих яичный желток и глюкозу или яичный желток и глицин. При добавлении в эти среды 10% глицерина 80—100% сперматозоидов жеребца переживали медленное охлаждение до —79° и последующее оттаивание.
Сообщали об успешном оплодотворении лошади замороженными сперматозоидами, взятыми из придатка. Их взвешивали в разбавителе, содержащем глицерин и молоко, охлаждали до —79° и хранили при этой же температуре в течение 30 дней. Применение искусственного оплодотворения свежей или замороженной спермой для разведения скаковых лошадей имеет своих противников. Известное сопротивление с их стороны, а также недостаточность средств и другие факторы экономического порядка могут задержать дальнейшее изучение физиологии сперматозоидов жеребца.
Сперматозоиды борова отличаются высокой активностью в среде, содержащей яичный желток и глюкозу или глицин, но их подвижность быстро снижается в присутствии 10% глицерина. При концентрации глицерина выше. 5% оплодотворяющая способность спермы также ухудшается. Вместе с тем около 50% сперматозоидов борова переживали охлаждение до —79° в глицино-желточной среде с примесью 10% глицерина. Когда концентрацию глицерина понижали до 7,5%, относительное количество подвижных сперматозоидов в оттаявших пробах уменьшалось до 30—40%. Тем не менее осеменение свиноматок замороженной спермой, содержащей глицерин, вызывало у них беременность.
Сперматозоиды кролика особенно чувствительны к повреждениям, которые может вызвать воздействие гипертонических солевых растворов как при нормальной температуре, так и при температуре ниже 0°, когда среда концентрируется благодаря вымерзанию из нее воды. Сперматозоиды кролика повреждаются также и при резком повышении концентрации глицерина в окружающей их среде. Только около 30% сперматозоидов переживали охлаждение до —79° в среде, содержащей 10% глицерина или 7,5% этиленгликоля. Когда глицерин добавляли постепенно путем диализа, сперматозоиды кролика сохраняли подвижность и оплодотворяющую способность даже при концентрации глицерина 30%. Большой процент их сохранял активность после охлаждения до —79°, но сперма утрачивала свою оплодотворяющую способность после замораживания и оттаивания. Тем не менее, Соколовской и Смирнову удалось получить нормальное потомство от самок кроликов, осемененных замороженной спермой.
Если судить по сохранению подвижности после оттаивания, сперматозоиды человека более устойчивы к замораживанию, чем сперматозоиды всех других млекопитающих, на которых проводили соответствующие опыты. Однако до настоящего времени крайне мало исследовали их оплодотворяющую способность после замораживания и оттаивания.
Имеется сообщение о четырех случаях беременности женщин в результате оплодотворения замороженной спермой, обработанной глицерином. Во всех этих случаях рождались вполне здоровые дети. Авторы указанного сообщения полагают, что данный метод может найти применение при некоторых случаях бесплодия у человека. Например, пробы семени, взятые у мужчины с олигоспермией, можно хранить в замороженном состоянии, затем оттаивать их, концентрировать и осуществлять оплодотворение в наиболее благоприятную фазу менструального цикла.
Некоторые авторы указывают на несоответствие между подвижностью и оплодотворяющей способностью сперматозоидов у определенных видов холоднокровных позвоночных. Так, Ростан сообщил, что сперматозоиды лягушки и жабы сохраняли подвижность после инкубирования в течение многих дней при температуре от —4 до —6° в присутствии 20% глицерина, но утрачивали способность оплодотворять яйца. Инкубирование в присутствии глицерина при температуре выше нуля также подавляло оплодотворяющую способность. В тоже время сперматозоиды сельди сохраняли оплодотворяющую способность после обработки глицерином и переживали хранение при температуре —79° в разбавленной морской воде с 12,5% глицерина. В связи с этим впервые появилась возможность произвести осеменение икры весеннего нереста осенними молоками и наоборот. Применение методики замораживания сперматозоидов открывает широкие перспективы для изучения возможности перекрестного оплодотворения как близкородственных, так и состоящих в отдаленном родстве видов рыб и животных, размножающихся в различное время и в различных местах. В некоторых случаях это поможет выяснить вопрос о принадлежности их к одному и тому же виду.
В настоящее время результаты замораживания сперматозоидов различных видов животных представляют собой весьма пеструю картину. Два положения, однако, вырисовываются достаточно четко: а) глицерин повышает выживаемость после воздействия низких температур у сперматозоидов всех испытывавшихся видов животных и б) охлаждение не должно быть слишком быстрым. Можно ускорить процесс разработки методик замораживания и хранения различных сперматозоидов при низких температурах, изучая их реакцию на изменения в составе суспензионной среды при температуре выше 0°. Тогда удастся избежать токсического действия некоторых веществ и преципитации других, а также изменений pH и других потенциально вредных физико-химических влияний замораживания среды. Полезно будет определить температурную зону, в пределах которой сперматозоиды получают повреждения при слишком медленном охлаждении в различных средах, а также температурную зону, в которой они чувствительны к слишком быстрому охлаждению. Большую пользу принесло бы лучшее понимание сущности и природы температурного шока при температурах выше и ниже нуля. Исследования с помощью электронной микроскопии и тонких физико-химических методов анализа также могут пролить свет на данную проблему. С точки зрения физиологии было бы целесообразно выявить причину несоответствия между подвижностью и оплодотворяющей способностью сперматозоидов в свежих и замороженных пробах спермы различных видов животных.
Не исключено, что диметилсульфоксид, который предохранял сперматозоиды быка от повреждений во время замораживания и оттаивания, или какое-нибудь другое нейтральное растворимое вещество будут лучше, чем глицерин, защищать сперматозоиды различных видов животных во время охлаждения и хранения при низких температурах.