Вопрос о внутреннем строении белкового комплекса клейковины и характере связи между составляющими его частями не разрешен до настоящего времени и для выяснения его необходимы дальнейшие углубленные экспериментальные исследования.
Рассмотрим вкратце существующие представления и гипотезы по этому вопросу. В течение долгого времени господствовало мнение, что клейковина — это комплекс двух белков — глиадина и глютенина, поэтому большинство теорий о строении клейковины исходило именно из этого представления и стремилось лишь выяснить характер связи между указанными белками, их взаимное расположение в составе клейковины и роль обоих компонентов для придания определенных свойств клейковине как единому целому.
Исходя из свойств очищенных препаратов глиадина и глютенина и считая, что эти белки находятся в составе клейковины в том же виде, как и вне ее, Осборн предполагал, что клейковина построена из твердых частиц глютенина, погруженных в полужидкую массу глиадина. Представления Осборна получили затем развитие в серии работ Берлинера и Коопмана (Berliner, Koopmann, 1927, 1929а, б), изучавших набухание и растворение клейковины в слабых кислотах, а также вязкость и микроскопическую структуру автоклавированных клейковинных золей. На основании своих опытов эти авторы пришли к выводу, что клейковина состоит из бесструктурного геля глиадина, в котором равномерно распределены твердые микроскопически видимые зернышки глютенина. Каждая частица глютенина окружена как бы глиадиновой оболочкой, причем связь между глиадином и глютенином является очень прочной, и полное разделение обоих белков возможно лишь при обработке кислотного золя клейковины в автоклаве.
Физические свойства клейковины по этой теория определяются соотношением глиадина и глютенина, а также степенью дисперсности глютенина, поскольку с увеличением общей поверхности глютениновых частиц возрастает связывание ими глиадиновой массы и, следовательно, вся клейковина становится более крепкой и упругой.
Нужно сказать, что представления Берлинера и Коопмана не встретили поддержки среди других исследователей, да и в последующих работах самих авторов они не получили дальнейшего развития. Слишком примитивным является взгляд на клейковинные белки как на микроскопически видимые образования. Совершенно очевидно, что если клейковинный
Белок и построен из двух фракций — глиадина и глютенина, то молекулы или мицеллы последних образуют весьма тесный комплекс и не могут быть, конечно, видимы под микроскопом в отдельности. Наконец, постулируемая авторами зависимость качества клейковины от соотношения глиадина и глютенина в ней не находит, как было показано выше, экспериментального подтверждения.
Другие исследователи (Luers, 1919; Mohs, 1931) предполагали, что глиадин и глютенин в составе клейковинного комплекса связаны между собой силами взаимной адсорбции, причем один из белков играет по отношению к другому роль защитного коллоида. Однако никаких экспериментальных доказательств адсорбционной природы взаимодействия указанных белков не имеется, а представление о защитном действии одного из них на другой было поставлено под сомнение работой А. И. Гершзон (1937в), показавшей взаимную коагуляцию спиртовых золей глиадина и глютенина.
Весьма интересная попытка экспериментального выяснения природы связи между фракциями, составляющими клейковину, была предпринята Бунгенберг де-Ионгом (Bungenberg De Yong, Klaar, 1929, 1931, 1952; Bungenberg De Yong, 1932, 1933). Он подробно изучил изменения мутности растворов глиадина и глютенина, смешиваемых в разных соотношениях, в зависимости от рН и присутствия электролитов. На основании отклонений показателей мутности смеси от закона аддитивности Бунгенберг де-Ионг развил теорию взаимодействия частиц глиадина и глютенина в зоне рН, лежащей между изоэлектрическими точками обоих белков, за счет их противоположных зарядов, в результате чего образуется бинарный протеиновый комплекс типа коацервата, во многом аналогичный однокомпонентному белку в его изоэлектрической точке. Максимальное комплексообразование происходит при равенстве противоположных по знаку зарядов обоих компонентов при определенном рН, величина которого зависит от соотношения компонентов в смеси и от присутствия электролитов. При других значениях рН один из компонентов, частицы которого сильно заряжены, уже в небольшом количестве полностью нейтрализует слабые заряды частиц другого компонента, вследствие чего первый из них участвует в комплексообразовании лишь частично, а избыток его играет роль коллоида, стабилизирующего систему.
Величины зарядов частиц глиадина и глютенина при различных значениях рН условно изображены знаками разного размера, а количество каждого белка в составе бинарного комплекса обозначено величиной соответствующего кружка. Рисунок показывает, как по обе стороны от точки максимального комплексообразования количества реагирующих, белков изменяются в обратной зависимости от величины их зарядов. Данные, полученные на препаратах глиадина и глютенина, Бунгенберг де-Ионг переносит на клейковину, считая, что последняя представляет собой естественный протеиновый комплекс типа коацервата, образовавшийся в результате взаимодействия противоположных зарядов частиц глиадина и глютенина. Физически автор представляет себе клейковину в виде системы из полужидкой массы глиадина, в которой распределены твердые частицы глютенина, причем увеличение количества последнего изменяет свойства клейковины в сторону ее укрепления. Бунгенберг де-Ионг приводит ряд соображений о влиянии рН среды, примесей других веществ и т. п. на соотношение глиадина и глютенина в клейковинном комплексе, а отсюда и на его физические свойства. Он отмечает, правда, что количественное соотношение глиадина и глютенина в клейковине не может определить полностью качества последней, однако его теория все же требует признания большой роли этого фактора, что плохо согласуется с действительностью.
Кроме того, результаты опытов автора со смесями глиадина и глютенина вряд ли могут быть полностью перенесены на естественную клейковину, отдельные фракции которой связаны, вероятно, не только силами ионного взаимодействия. Все же следует признать, что исследования Бунгенберга де-Ионга являются весьма интересной попыткой приблизиться к пониманию природы взаимодействия отдельных частей клейковинного комплекса и продолжение этих работ применительно к естественной клейковине представляется очень желательным.
Для обоснования взгляда на клейковину как на комплекс двух индивидуальных белков — глиадина и глютенина — очень существенным является искусственное приготовление клейковины из очищенных препаратов этих белков. Такие попытки делались неоднократно, но только в недавнее время они привели к положительному результату (Шкловский, 1957).
Еще в 1922 г. Вудмен (Woodman, 1922) сообщил, что при увлажнении смеси сухих препаратов глиадина и глютенина, приготовленных по Осборну, клейковину получить не удается. Наиболее обстоятельные опыты в этом направлении были проведены М. С. Резниченко и Е. А. Алякринской (1936). Указанные авторы, убедившись в невозможности получения клейковины при смешивании сухого глиадина и глютенина в самых различных соотношениях, пытались достигнуть более тесного соединения обоих белков путем совместного осаждения их из раствора в слабой кислоте, нейтрализуемой до рН 6,0 как непосредственно, так и в присутствии различных солей. Осаждаемая таким образом смесь белков ни в одном случае не имела сходства с клейковиной. Те же авторы показали далее, что уже однократная обработка муки 70%-ным спиртом, удаляемым затем отгонкой в вакууме, уменьшает количество сырой клейковины в этой муке и ухудшает ее физические свойства. Если же мука обработана 70%-ным спиртом несколько раз, экстракты соединены с остатком и спирт удален в вакууме, то из полученной тестообразной массы клейковина совсем не отмывается.
Из этих опытов авторы сделали вывод, что глиадин денатурируется в процессе выделения его спиртом и именно поэтому из препаратов глиадина и глютенина не удается вновь получить клейковину. В недавнее время И. Ш. Шкловский подробно исследовал влияние этилового спирта на процесс формирования сырой клейковины при замешивании теста. Оказалось, что спирт не разрушает полностью клейковинного комплекса, но сильно затрудняет слипание мельчайших частиц клейковины в общую массу. Если применять очень осторожное и тщательное отмывание с помощью тонких сит, то из муки, обработанной 50—90%-ным спиртом, удается выделить сырую клейковину. Таким образом, предположение М. С. Резниченко и Е. А. Алякринской о денатурирующем действии спирта на глиадин не подтвердилось. Кроме того, давно известно, что при добавлении к муке препарата глиадина выход сухой клейковины соответственно возрастает и, следовательно, глиадин в процессе выделения не теряет способности участвовать в формировании клейковины. Глютенин же заметно денатурируется спиртом, что видно, например, из данных Кука и Алсберга (Cook, Alsberg, 1931), показавших, что этот белок полностью утрачивает способность пептизироваться в водном растворе мочевины, если материал подвергался воздействию спирта.
При обычном же препаративном получении глиадина и глютенина основным денатурирующим фактором является не спирт, а щелочь и если не применять ее, то в ряде случаев удается вновь «синтезировать» клейковину из ее компонентов. Так, еще в 1908 г. Бекер и Халтон (Baker, Hulton, 1908) получили клейковину из смеси глиадина и сухого остатка муки после извлечения глиадина спиртом. В этом опыте глютенин совсем не выделяется в виде препарата.
Позднее В. Л. Кретович (1938) разделил сухую клейковину на глиадин и остаток, содержавший глютенин, а затем, смешав оба сухих препарата и прибавив воду, получил типичную сырую клейковину. Этот опыт, явившийся первым случаем получения клейковины из ее более или менее очищенных и сухих компонентов, убедительно показал, что главным денатурирующим фактором в процессе выделения клейковинных белков является щелочь, отказавшись от применения которой можно избежать обычного денатурирования глютенина.
Исходя из этих соображений, И. Ш. Шкловский (1957) приготовил чистый препарат глютенина пшеницы по методу Блиша и Сандстедта, осадив его из дисперсии сырой клейковины в 0,01 п уксусной кислоте, содержащей 70% метилового спирта, путем осторожной нейтрализации этой смеси до изоэлектрической точки глютенина. При тщательном смешивании приготовленного таким способом глютенина с препаратом глиадина (выделенного методом Осборна), увлажнении смеси и растирании ее в ступке была получена типичная сырая клейковина. «Синтетическая» клейковина содержала 17% азота (на сухое вещество), 62% влаги и характеризовалась величиной удельной растяжимости порядка 0,15— 0,20 см/мин. Органолептически и по скорости истечения на пластометре она была крепче исходной клейковины той же муки. После высушивания в вакууме при 35° сухой порошок синтетической клейковины при добавлении сто к муке увеличивал выход отмываемой из муки клейковины в полном соответствии с количеством добавленного препарата. Качество «синтетической» клейковины зависит от соотношения в ней глиадина и глютенина. Глиадин придает клейковине растяжимость и клейкость, при избытке же глютенина клейковина становится малосвязной, короткорвущейся. Наиболее близка к естественной «синтетическая» клейковина, приготовленная из равных весовых частей глиадина и глютенина.
Работа И. Ш. Шкловского впервые продемонстрировала возможность искусственного получения клейковины из хорошо очищенных препаратов глиадина и глютенина и в этом отношении она представляет значительный интерес.
После того как выяснилось, что глиадин и глютенин не являются химически индивидуальными, гомогенными веществами и клейковина может быть разделена на ряд иных фракций, появились новые представления о внутреннем строении клейковинного комплекса. Некоторые из них непосредственно примыкают к старым воззрениям в том отношении, что клейковина рассматривается как комплекс двух или трех фракций, каждая из которых построена в свою очередь из белковых мицелл различной величины. Так, А. Г. Кульман в ряде работ (1937а, б, 1940′, 1949, 1953) развивает представление о клейковине как адсорбционном комплексе белковых мицелл трех типов, различающихся по степени агрегации и мицеллярному весу. Эти фракции обозначаются как а-глиадин, (3-глиадин и глютенин, причем низкомицеллярная фракция а-глиадина играет роль пептизатора более высокоагрегированных фракций бета-глиадина и глютенина.
Блиш и его сотрудники (Blish, 1945, 1946; Sandstedt, Blish, 1933) рассматривают клейковину с точки зрения теории Зеренсена (Sorensen, 1930) о строении растворимых белков. Согласно этой теории, последние представляют собой обратимо диссоциирующие компонентные системы, отдельные компоненты которых удерживаются относительно слабыми силами дополнительной валентностн и способны к обратимой диссоциации, тогда как внутри каждого компонента действуют прочные гомеополярные связи. В зависимости от внешних условий (температура, рН, концентрация и характер солей) компоненты различных систем, диссоциируя в большей или меньшей степени, обратимо соединяются между собой в самых различных сочетаниях, образуя большое разнообразие фракций, отличающихся друг от друга по составу и свойствам и способных при изменении условий вновь диссоциировать и давать начало другим компонентным системам, т. е. новым фракциям.
В тех случаях, когда соединение компонентов приводит к образованию нерастворимой компонентной системы, последняя выделяется из раствора в виде осадка белка. Фракционирование путем осаждения и состоит, по Зеренсену, в созданий таких условий, при которых происходит постепенное образование нерастворимых компонентных систем.
При соблюдении постоянной методики можно выделять одни и те же белковые фракции, тогда как всякое изменение условий будет приводить к сдвигу равновесия в обратимо диссоциирующих системах и, следовательно, к получению уже иных фракций.
Применяя представления Зеренсена к белкам клейковины и исходя из своих опытов но разделению последней на три главные фракции — глиадин, мезонин и глютенин, Блиш рассматривает каждую из этих фракций, как обратимо диссоциирующую компонентную систему, состоящую из многих рыхло связанных компонентов, способных в зависимости от условий диссоциировать и соединяться в новые компонентные системы. Многообразие возникающих при этом сочетаний и является причиной большого количества фракций, на которые можно разделить клейковину, если варьировать условия ее фракционирования. Все же число исходных компонентных систем в клейковине ограничено, и условно можно считать, что последняя представляет собой сочетание трех таких систем: глиадина, мезонина и глютенина, связанных в единое целое, причем о характере связи между системами Блиш не высказывает никаких предположений.
В противоположность взглядам Блиша, канадские исследователи Мак-Колла и Роуз (McCalla, Rose, 1935), Спенсер и Мак-Колла (Spencer, McCalla, 1938), Мак-Колла и Грален (McCalla, Gralen, 1940, 1942) развивают представление, согласно которому клейковина является единым белковым комплексом, состоящим из неограниченного числа фракций, расположенных в порядке постепенного изменения их химического состава и свойств. Это представление основывается на работах указанных авторов по фракционированию клейковинных белков с помощью салицилата натрия, причем, как уже упоминалось выше, удается получить ряд фракций, неоднородных по химическому составу и совершенно отличных от глиадина или глютенина. Что касается характера связи между фракциями в составе клейковинного комплекса, то вопрос этот остается невыясненным.
Подводя итоги изложенным представлениям о внутренней структуре клейковины, приходится, прежде всего, отметить крайнюю недостаточность экспериментальных данных для обоснования какой-либо определенной теории строения клейковины. Вместе с тем ясно, что привычное представление о клейковине как комплексе двух индивидуальных белков — глиадина и глютенина — устарело и не соответствует дейст-вительности. Глиадин и глютенин являются, по-видимому, лишь осколками белкового вещества клейковины, получаемыми при строго определенной методике ее расщепления, тогда как применяя другую методику, можно получить совершенно иные части того же исходного белка.
Представление Блиша о трех главных компонентах клейковины столь же условно, как и классическая теория Осборна о двух клейковинных белках, поскольку небольшие изменения в методике фракционирования могут привести к получению не двух или трех, а гораздо большего числа белковых фракций. Что касается теории Зеренсена о белках как обратимо диссоциирующих компонентных системах, то применение ее к клейковине требует доказательства полной обратимости разделения последней на фракции, а таких доказательств не только нет, но и сомнительно, чтобы они могли быть получены. Наконец, весьма неопределенными кажутся и взгляды канадских исследователей, согласно которым клейковина представляет собой комплекс неограниченного числа фракций, расположенных в порядке последовательного изменения их состава и свойств.
То обстоятельство, что в зависимости от применяемой методики из одной и той же клейковины можно получить весьма различные белковые фракции, может быть объяснено с наибольшей полнотой, если считать, что клейковина представляет собой единое белковое вещество, построенное достаточно сложно и способное расщепляться в зависимости от применяемых реагентов во многих местах с образованием то одних, то других осколков, заметно отличающихся друг от друга но химическому составу и свойствам. Например, если действовать на клейковину разбавленным этиловым спиртом, то в результате расщепления определенных связей внутри частицы клейковинного белка выделяется фракция, называемая глиадином. Солевые растворы, салицилат натрия, мочевина и другие вещества действуют на клейковину иначе, чем спирт; расщепление при этом идет по другим связям и соответственно этому выделяются иные фракции. Естественно, что, даже действуя одним и тем же реагентом, но в неодинаковых условиях, можно подвергнуть расщеплению то большее, то меньшее число внутренних связей клейковинного белка и получить в результате не вполне одинаковые фракции. Это и наблюдается в действительности, когда, например, небольшие отклонения в методике получения глиадина приводят к выделению не идентичных белковых препаратов.
Нужно сказать, что представление о клейковине как о едином белковом веществе высказывалось неоднократно. Так, например, М. И. Княгиничев и Т. М. Горелкина (1937) на основании опытов по растворимости клейковины в водных растворах салицилата натрия пришли к заключению, что клейковину следует рассматривать как единый белковый комплекс, а не сумму индивидуальных белков. Аналогичный взгляд был высказан также Ричем (Rich, 1936, 1938) и другими авторами. Следует, впрочем, отметить, что, говоря о клейковине как о едином белковом комплексе, указанные исследователи не уточняли вопрос о его внутреннем строении и лишь подчеркивали, что отдельные фракции клейковины связаны известным образом между собой, а не составляют простую смесь. При этом в большинстве случаев подразумевалось, что связь отдельных фракций внутри клейковинного комплекса носит сорбционный характер, и клейковина представляет собой коллоидную систему, построенную из мицелл различной формы и величины.
В 1952 г., изучая процесс образования клейковины при созревании пшеницы, мы установили, что на протяжении всего периода созревания зерно не содержит отдельных белков — глиадина и глютенина — в свободном состоянии (Вакар, 1952). С самого начала формирования зерна глиадин и глютенин могут быть обнаружены в нем только в вице фракций единого клейковинного комплекса, физико-химические свойства которого претерпевают, правда, в процессе созревания зерна заметные изменения. На основе этих опытов и критического рассмотрения имеющихся в литературе данных было выдвинуто представление (Вакар, 1952), согласно которому клейковина построена из однородных белковых макромолекул, имеющих сложную пространственную структуру и включающих наряду с полипептидной и циклической гомеополярными связями ряд других менее прочных связей и «мостиков» между отдельными полипептидными или циклическими участками. Расщепление этих менее прочных связей (например, дисульфидных, водородных и др.) под влиянием определенных реактивов может приводить к дезагрегации первоначальной макромолекулы на ряд осколков или фракций, число и характер которых определяются условиями расщепления. Согласно представлениям современной химии высокополимерных веществ, отдельные макромолекулы клейковины под влиянием сил межмолекулярного взаимодействия (силы Ван-дер-Ваальса) должны располагаться в более или менее ориентированном порядке, причем степень взаимодействия макромолекул, называемая обычно «плотностью упаковки», зависит от наличия тех или иных химических группировок в соседних макромолекулах клейковины.
Небольшие изменения в характере взаимодействующих активных групп могут резко изменить «плотность упаковки» макромолекул, а последняя определяет собой физические свойства высокополимера: его упругость, растяжимость, пластичность, хрупкость и т. д. Таким образом, с точки зрения химии высокополимеров становится понятной до сих пор нерасшифрованная связь между химическим строением клейковины и ее физическими свойствами. Решающим для изменения последних является связывание, замещение или расщепление тех активных групп, через которые осуществляется взаимодействие соседних макромолекул, т. е. их «упаковка». При этом во многих случаях в результате изменения тех или иных химических группировок в макромолекулах происходит не только усиление межмолекулярного взаимодействия (возрастание сил Ван-дер-Ваальса), но и образование новых связей путем «сшивания» нескольких макромолекул поперечными мостиками в единое целое. Подобное явление происходит, например, при вулканизации каучука, когда отдельные макромолекулы последнего соединяются мостиками из атомов серы, образуя вещество с иными физическими свойствами, чем исходный каучук.
При всяком усилении взаимодействия соседних макромолекул полимера, путем ли увеличения «плотности упаковки» или путем возникновения поперечных мостиков главной валентности, жесткость всей системы увеличивается, и потому крепкая, короткорвущаяся клейковина должна отличаться от слабой, растяжимой именно более сильным взаимодействием своих макромолекул. В этой плоскости, по-видимому, и следует искать теоретического объяснения таких явлений, как, например, уплотнение клейковины под влиянием ненасыщенных жирных кислот или ее дезагрегация протеолитическими ферментами. В первом случае может иметь место окисляющее действие двойных связей ненасыщенных жирных кислот на сульфгидрильные (—SH) или пептидные (—CONH—) группировки клейковины, в результате чего возможна спайка соседних макромолекул через дисульфидные или азотные мостики, что приведет к значительному увеличению жесткости всей клейковины. Во втором случае, т. е. при дезагрегации клейковины протеолитическими ферментами изменение ее начинается, вероятно, с уменьшения «плотности упаковки» макромолекул, а затем уже затрагиваются и валентные связи внутри последних. Наконец, зависимость между физическими свойствами клейковины и способностью ее к гидратации можно объяснить тем, что при изменении «плотности упаковки» макромолекул изменяется также количество ‘воды в пространствах между отдельными макромолекулами.
Изложенные выше представления встретили сочувственный отклик у ряда исследователей (Кульман, 1953; Ауэрман, 1956; Островский, 1959), однако в настоящее время они высказаны только в самой общей форме и для доказательства и конкретизации их необходима большая и разносторонняя экспериментальная работа. В последнее время И. Ш. Шкловский (1955, 1957) развил другую гипотезу внутреннего строения клейковины. На основании своих опытов по «синтезу» клейковины из препаратов глиадина и глютенина, а также опытов по действию спирта на формирование сырой клейковины в тесте, указанный автор считает, что клейковина представляет собой продукт «слипания» (когезии) двух отдельных белков: глиадина и глютенина. Слипание этих белков происходит еще в созревающем зерне, которое в дальнейшем содержит не отдельные белки — глиадин и глютенин, но частицы продукта их слипания — клейковины. При замешивании теста и отмывании клейковины возникает процесс «самослипания» (аутогезии) ее мельчайших частичек в общую связную и эластичную массу.
Таким образом, по И. Ш. Шкловскому, клейковина состоит из двух белковых компонентов, соединенных сравнительно непрочными силами «слипания», т. е. заклинивания отдельных, главным образом, концевых участков молекулярных цепей одного белка в поверхностном слое другого белка. Получается нечто вроде частичного растворения одного белка в другом или образование из них «сплава». Эта гипотеза не объясняет легкости разделения клейковины на иные фракции, отличные от глиадина и глютенина. Непонятным остается и факт диспергирования клейковины целиком раствором салицилата натрия, который, по нашим данным (Вакар, 1952), растворяет глиадин и почти не растворяет глютенин. При отсутствии прочной связи между этими белками раствор салицилата натрия, действуя на клейковину, растворял бы только глиадин, оставляя глютенин в осадке, как это и наблюдалось в опытах (Вакар, 1952) при действии раствором салицилата на смесь препаратов глиадина и глютенина. Фактически же раствор салицилата натрия диспергирует клейковину целиком, т. е. будучи способным преодолеть силы «самослипания» между частицами клейковины, он не может в то же время преодолеть сил «слипания» глиадина и глютенина. Это говорит, по нашему мнению, не в пользу гипотезы слипания глиадина и глютенина, но свидетельствует о более прочной связи между ними в составе клейковины. Что же касается вопроса о «самослипании» мельчайших частичек клейковины (а не отдельных ее фракций) при замешивании теста и отмывании сырой клейковины, то в этой части гипотеза Шкловского не встречает возражений.
В заключение необходимо вновь со всей определенностью подчеркнуть, что в настоящее время нет достаточных оснований для того, чтобы принять целиком ту или иную гипотезу или теорию строения клейковины. Только основательные и разносторонние экспериментальные исследования смогут выяснить полностью этот весьма сложный вопрос.