Мир «невидимок» предстанет перед нами во всем своем многообразии и великолепии, если мы будем пользоваться для их обнаружения специальными приборами — микроскопами.
Развитие оптики и электроники позволило добиться больших успехов в области совершенствования оптических приборов, с помощью которых мы можем получить увеличение не видимых невооруженным глазом микробов от 3000 до 300 000 раз. В настоящее время имеются самые разнообразные микроскопы: световой, фазовоконтрастный, стереоскопический, ультрафиолетовый, люминесцентный, поляризационный и наиболее совершенный — электронный.
Изобретение фазово-контрастного микроскопа в 1935 г. физиком Цернике дало возможность в живом виде рассматривать тонкое строение микробной клетки. По прошествии двадцати лет Цернике был удостоен Нобелевской премии.
В эти годы был изобретен и электронный микроскоп, где роль световых лучей играют электроны, их движением управляют электромагниты, выполняющие функцию оптических линз; электронные микроскопы дают увеличение объекта в несколько сот тысяч раз. Для исследования строения микробных клеток в электронном микроскопе производится предварительное приготовление сверхтонких срезов с помощью ультрамикротома. Таким способом можно разрезать белое кровяное тельце — лейкоцит (диаметром около 15 мкм) на 750 тончайших срезов, каждый из которых не толще 0,02 мкм.
После открытия мира микробов долгое время господствовало мнение о невозможности подвергнуть их систематике, многие были склонны считать, что это «хаос», который нельзя понять. В растительном и животном мире есть так называемая «бинарная номенклатура», принятая еще со времен Карла Линнея (1761), это положение стали применять и к микробам. Основная систематическая единица в микробиологии — вид, близкородственные виды объединяются в роды, роды — в семейства, семейства — в порядки, порядки — в классы. Высшая систематическая единица — царство. Бактерии относятся к царству прокариотов; при обозначении того или иного микроорганизма с заглавной буквы вначале пишется родовое название, а затем название вида. Например, возбудитель сибирской язвы называется Бациллюс антрацис, иногда вид называется именем ученого, открывшего данный микроб.
Систематика бактерий и их классификация — один из самых неразработанных разделов микробиологии. Классификация семейств у родов основана на морфологическом принципе, весьма недостаточном для систематики микроорганизмов. Использование биохимических и физиологических признаков часто не дает возможности точно установить принадлежность того или иного микроба к определенному виду. Микроорганизмы обладают способностью к изменению своих форм и обмену веществ, что весьма затрудняет их изучение. При определении бактерий используются самые разнообразные их свойства: способность образовывать пигменты — красящее вещество, практическое значение (молочнокислые бактерии образуют молочную кислоту, ацетонобутиловые — ацетон и бутанол), особенности роста и т. д. В настоящее время разработаны точные методы систематики, связанные с определением нуклеотидного состава ДНК, а также сходство признаков с применением электронно-вычислительных машин (ЭВМ) и другие методы. При использовании ЭВМ учитывается большое число свойств бактерий (около 50), которые фиксируются в таблицах или на перфокартах и закладываются в «память» машины. Общее сходство между отдельными культурами вычисляют с помощью коэффициентов корреляции, расстояния, ассоциации, т. е. определяют коэффициент сходства. На основании результатов вычисления получают таблицы (матрицы) сходства, в которых величина выражена в цифрах, а в последующем составляются так называемые дегидрограммы, на основании которых и определяют отношение микробов к определенным видам.
Методы и подходы, которые применяются в исследованиях по систематике, становятся все разнообразнее и основываются на достижениях других наук (серологические, генетические и цитологические).
Международная комиссия по систематике микроорганизмов издала в 1974 г. (8 издание) солидный определитель под редакцией Бердже. В составлении этого определителя принимали участие специалисты всех стран мира, в том числе и Советского Союза.
Все живые организмы на основании своей структуры делятся на две большие группы. Более сложное строение имеют клетки растений, животных, простейших, грибов и водорослей, они объединены под названием эукариотов. Бактерии и сине-зеленые водоросли имеют менее сложное строение — их называют прокариотами. Первичное подразделение клеточных организмов, принятое в настоящее время, следующее:
|
Эукариоты |
Многоклеточные |
Растения |
|
выраженная дифференциация клеток и тканей |
семейные, папоротники, мхи, печеночники |
|
|
Животные: позвоночные, беспозвоночные |
||
|
Одноклеточные, образующие многоядерные клетки или мицелий: последние с незначительной дифференциацией клеток и тканей или без нее |
Протисты: водоросли, простейшие грибы |
|
|
Прокариоты |
Бактерии |
Граница между эукариотической и прокариотической клеткой — наиболее важное и глубокое из всех обусловленных эволюцией различий в современном мире живого.
Бактерии, дрожжи, простейшие, многие водоросли, некоторые микроскопические грибы — все это одноклеточные представители мира микробов. Микроорганизмы измеряются очень малыми единицами: микрометр (мкм) — тысячная доля миллиметра, нанометр (нм) — миллионная доля миллиметра или ангстрем (Å) — десятимиллионная часть миллиметра. Большинство клеток бактерий имеют величину в пределах 0,5—1 мкм, но есть клетки меньших размеров и большие, достигающие в длину нескольких микрометров. Вообще можно считать, что клетки микроорганизмов — это живые существа бесконечно малых размеров. И под словом «микробы» подразумевается сборное название для очень обширной группы существ, не видимых невооруженным глазом.
Бактерии, населяющие нашу планету, несмотря на свое обилие и разнообразие свойств внешне имеют только три формы: шаровидную (кокковидную), палочковидную (цилиндрическую) и извитую (спиралевидную).
Многие микроорганизмы имеют форму палочек размером от 0,2 до 1,5—2 мкм, располагаться они могут по-разному: беспорядочно, парами, цепочками. В клетках шаровидных или овальных телец есть образования, называемые спорами. Бактерии, образующие споры, выделяются в группу бацилл. Возбудитель такой страшной болезни, как столбняк, имеет форму палочки, а на конце ее находится круглая спора, микроб напоминает форму барабанной палочки. Споры очень долго, на протяжении многих десятков и сотен лет, могут сохранять жизнеспособность, они выносят высушивание, замораживание. Форму палочки имеют возбудители тифа, дизентерии, дифтерии и многие другие микробы.
У некоторых микробов есть органы движения — жгутики. Количество их может быть от 50 до 100, а иногда два, три или один (например, у вибрионов). Жгутики можно видеть в обычном микроскопе только при определенной обработке, в электронном микроскопе они видны хорошо. Помимо жгутиков у бактерий бывают бахромки, служащие органами прикрепления.
Некоторые бактерии имеют изогнутую форму в виде запятой, их называют вибрионами от латинского слова «трепещущий», что указывает на активную подвижность вибрионов. Форма вибриона у возбудителя холеры. Есть микроорганизмы и в форме спирали — это спирохеты.
Развитие электронной микроскопии позволило ученым проникнуть внутрь микробной клетки. Удивительная организация! Как правило, бактерии имеют одну клетку, и в той мельчайшей клеточке размером в 0,5 мкм, сосредоточена огромная лаборатория, которая обладает чудодейственными свойствами: это обмен веществ, который складывается из питания, переваривания (будем грубо называть) «пищи», энергия движения, выделение тепла, образование различных ферментов, размножение, передача наследственных свойств от материнской клетки к дочерним. Некоторые микроорганизмы способны к невероятному синтезу чрезвычайно полезных для человека ценных веществ: витаминов, белков, жиров, углеводов. Многие выделяют антибиотики и т. д. Микробная клетка может служить моделью для изучения сложнейших процессов, протекающих в живых организмах. Если мы постигнем тайны ее существования, многое откроется человечеству в познании существа биологической организации живых организмов в природе…
Какова же анатомия микробной клетки, что мы знаем о ее внутренней организации?
Все микробы имеют клеточную стенку — это тонкая бесцветная оболочка, покрывающая клетку снаружи и обусловливающая ее форму. Если бактерия лишается стенки, а это бывает в случае действия антибиотика (пенициллина или лизоцима), то появляются так называемые оголенные протопласты или сферопласты, в этом случае бактерии не имеют постоянной формы. У многих бактерий клеточная стенка часто покрыта слоем слизи, она называется капсулой. Под оболочкой расположена цитоплазматическая мембрана, являющаяся очень важным образованием, поскольку в ней сосредоточены особые белковые вещества — пермеазы, с помощью которых питательные вещества проникают в протоплазму, она поддерживает осмотический барьер клетки. Цитоплазматическая мембрана окружает цитоплазму— это коллоидная масса, вязкая, как глицерин, состоящая на 70—80% из воды. Она заполняет внутреннюю полость клетки. В цитоплазме находятся пузырьки воздуха — вакуоли, запасные белковые вещества, гликоген, капельки жира, белковые вкрапления и нуклеотид — ядерная структура (ДНК).
У большинства бактерий ядро часто недифференцированно, т. е. представляет вкрапления в цитоплазму частиц ДНК. Ядро бактерий называют нуклеотидом, он не отделен от протоплазмы перегородкой и находится непосредственно в контакте с цитоплазмой. Ядро несет очень важную функцию: прежде всего оно обеспечивает передачу наследственных свойств материнской клетки потомству (дочерним клеткам), а ответственность за это несет молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты. Если клетка находится в покоящемся состоянии, она содержит один нуклеотид, перед делением — два, в период деления — до четырех и более. В настоящее время получены электронные фотографии ДНК и установлено, что она не имеет концов, а представлена замкнутой структурой.
В цитоплазме микробов находятся мелкие частицы (от 150 до 350 Å), количество которых может достигать до 5000. Это — рибосомы, они являются центром синтеза белка в клетке. У некоторых бактерий обнаружены мембранные структуры в виде завитков (мезосомы), это энергетические станции клеток. В них протекают важные процессы преобразования веществ, они участвуют в окислительно-восстановительных реакциях и, по-видимому, играют определенную роль в процессе деления клеток. Маленькая клеточка вмещает такую организацию, которой может позавидовать сложное оборудование большого промышленного комплекса, в ней царит строгий порядок и осуществляется целесообразное и планомерное разделение труда.
Существует большое разнообразие микроорганизмов, обладающих своеобразными особенностями строения, биологии и развития.
Особую форму микроорганизмов составляют сине-зеленые водоросли, они бывают одноклеточными и многоклеточными. Одноклеточные по размерам сходны с бактериями и имеют форму палочки или кокка. Многоклеточные представляют собой длинные нити, состоящие из отдельных клеток, они в больших количествах населяют проточные и сточные воды. По сходству близко примыкают к сине-зеленым водорослям так называемые бесцветные серобактерии, которые обитают в морских и пресных водоемах, содержащих в большом количестве кислород и сероводород. Железобактерии также имеют длинные нитевидные клетки и находятся в водных источниках.
Своеобразную группу бактерий, широко распространенных в природе, составляют актиномицеты, или лучистые грибы. Основное место их нахождения — почва, вода, останки животных и остатки растений. Форма у них весьма примечательная — это длинные тонкие ветвящиеся нити, переплетенные между собой. Многие актиномицеты вырабатывают антибиотики, используемые человеком в борьбе с болезнетворными микробами.
Микробиологи изучают большую группу грибов, так называемых фунги. Их насчитывают свыше 70000 видов. Они играют важную роль в круговороте веществ в природе, разрушая и минерализуя органические соединения. Грибы находят широкое применение в промышленности при производстве вина, пива, в хлебопечении и других отраслях народного хозяйства. В медицине они используются как продуценты антибиотиков. Многие грибы паразитируют на растениях, некоторые вызывают заболевания у человека — микозы. Размеры грибов разные: одни — очень мелкие (рассмотреть их можно только под микроскопом), другие — видны невооруженным глазом (шляпочные лесные грибы).
Возьмем сыр «Рокфор», он имеет вкрапления зеленоватой окраски, со специфическим вкусом и запахом. Под микроскопом видны микроскопические грибы в виде длинных переплетений нитей, носящих название гифов, они имеют перегородки, разделяющие отдельные клетки, в каждой из них есть ядро. Гифы, переплетаясь, образуют местами «кисточки», на концах которых образуются споры. Это не что иное, как зеленая плесень — кистевик («пенициллиум» от латинского слова «кисточка»). Зеленую окраску, вкус и запах сыру придает этот грибок. Пенициллы растут на молочных продуктах, варенье, в чернилах и т. д., они продуценты антибиотиков, в частности, пенициллина. Некоторые виды патогенны, вызывают заболевания кожи, ногтей, легких и других органов.
Наиболее простые по строению грибы — одноклеточные дрожжи. Нам хорошо известны пекарские дрожжи — спрессованные живые клетки дрожжевых грибов. Гели кусочек пекарских дрожжей развести в воде и капельку поместить на предметное стекло, покрыть другим тонким покровным стеклом и рассмотреть под микроскопом, то мы увидим очень интересную картину: в поле зрения микроскопа много округлых и овальных клеток, видна двухслойная оболочка, протоплазма, в центре — ядро с ядрышком. Внутри протоплазмы много разных включений. Иногда видны на клетках выросты — это почки. Отделившись от материнской клетки, почки превращаются в новые самостоятельные особи. Дрожжи обитают на растениях, в частности на плодах, при домашнем приготовлении вина вызывают брожение соков. Имеют очень большое промышленное применение, с помощью дрожжей получают хлеб, спирт, вино, пиво и т. п.
Широко распространены слизистые бактерии — миксобактерии. Это палочковидные клетки, окруженные слизью, подвижные благодаря топкой, пластичной стенке. Они могут изгибаться и менять свою форму, как бы скользя по поверхности. Многие миксобактерии образуют плодовые тела различной формы и размеров. Они распространены в почве, навозе, на разлагающейся древесине, иле водоемов и в других местах, бывают окрашены в оранжевый и другие цвета.
Существуют особые микроорганизмы, обладающие способностью менять свою форму и размеры, — это так называемые микоплазмы и z-формы бактерий. Эти клетки не имеют твердой клеточной стенки, поскольку утратили оболочку под влиянием антибиотиков, а поэтому всякий раз меняют свою форму.
Очень опасны схожие с бактериями микробы — риккетсии, названные в честь американского ученого Гаварда Риккетса, который обнаружил их в 1909 г. в крови больных мексиканским сыпным тифом и в кишечнике вшей, являющихся переносчиками этих риккетсий. Диалогичные микроорганизмы были обнаружены в 1913 г. чешским ученым Провачеком в кишечнике вшей, снятых с больных европейским сыпным тифом. Провачек и Риккетс погибли во время опытов от сыпного тифа. Риккетсии — это мелкие, овальные палочковидные или нитевидные формы, и в отличие от бактерий они размножаются только в организме животных или в живых тканях. Это вредные спутники людей и животных, они вызывают инфекционные заболевания (сыпной тиф, лихорадку Ку, траншейную лихорадку, пятнистую лихорадку скалистых гор, от которой 90% заболевших людей умирает). Некоторые виды риккетсий вызывают заболевание крупного и мелкого рогатого скота.
Познакомившись с морфологией микробов, интересно узнать, из каких же химических элементов состоит микробная клетка?
В клетках бактерий содержится 75—90% воды от общей массы. Вода играет важную роль, ибо служит растворителем многих органических и минеральных веществ до отдельных молекул, и только в растворенном виде эти вещества могут проникать в протоплазму. Потеря воды нарушает клеточные структуры и вызывает гибель клетки. Сухое вещество тела микроорганизмов состоит в основном из органических соединений — белков, углеводов, жиров и др. Среди органических веществ клетки на долю белков у бактерий приходится 50—80% от массы сухих веществ, они являются структурными элементами клеток и состоят из отдельных аминокислот, которые находятся в многочисленных комбинациях и сочетаниях. Общее количество свободных аминокислот составляет 200—500 мг на 1 г клеток. Простые белки, соединяясь с небелковыми компонентами, образуют сложные белки.
Белки клеточного ядра — нуклеопротенды — состоят из РНК (рибонуклеиновая кислота) и ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота). В среднем РНК составляет до 10% сухой массы клетки. Роль этого соединения огромна, так как с помощью РНК осуществляется синтез белка клетки. Общее содержание ДНК составляет 3—4% от сухой массы, она является материальной основой наследственности, в ней находится вся информация наследственных свойств микроорганизмов.
В клетках микроорганизмов большое значение имеют также углеводы, встречающиеся в виде пентоз, гексоз, полисахаридов — гликогена, гранулезы, декстрина и клетчатки. Углеводы используются для построения белков, жиров, участвуют в построении клеточных оболочек и капсул, служат энергетическим материалом в дыхательных процессах бактерий.
Содержание жиров и липоидов в микроорганизмах составляет обычно до 3—7% от массы сухих веществ. Они находятся в протоплазме в виде включений, а также входят в состав протоплазмы и клеточных оболочек в виде липопротеидов. Жировые вещества используются как энергетический материал и запасные питательные вещества.
Различные красящие вещества — также органические соединения и в значительном количестве содержатся во многих бактериях и грибах. Минеральные вещества составляют не более 15% от массы сухих веществ, они регулируют осмотическое давление внутри клетки. В этом отношении особенно велика роль калия, магния, железа и других элементов. Большое значение имеет фосфор. Он входит в состав белков и других важнейших соединений цитоплазмы и принимает участие в процессах обмена веществ.
Микробы, как и все живые организмы, нуждаются в наличии достаточного количества пищи, необходимой для проявления всех жизненных процессов клетки. Но ведь микробы в большинстве своем одноклеточные организмы, не видимые невооруженным глазом. У них нет органов пищеварения. Как же все-таки к ним поступают питательные вещества, как происходит усвоение и выделение продуктов отброса?
Эта маленькая клеточка должна получать такое «меню», которое содержит легкоусвояемые источники углерода, азота и других необходимых соединений. Обмен веществ (метаболизм) у микробов складывается из двух взаимосвязанных процессов. Это прежде всего поступление питательных веществ в клетку из окружающей среды и следующее за этим образование сложных органических соединений: белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов. Процесс синтеза связан с потреблением клеткой свободной энергии. Одновременно в клетке происходит распад сложных органических соединений до простых элементов, что сопровождается образованием свободной энергии.
Для проявления всех жизненных процессов (питания, дыхания, размножения, роста) любая живая клетка нуждается в постоянном притоке энергии, которую она получает в процессе обмена веществ. Механизм питания заключается в поступлении и усвоении пищи, но она должна предварительно подвергаться сложным превращениям и переработке. Прежде всего питательные вещества расщепляются под действием ферментов на простые соединения. Процессы распада сопровождаются строительным обменом, когда микробная клетка из мономеров, свойственных данному организму, образует «строительные белки» — «кирпичики», являющиеся основой всех клеточных макромолекул клетки. Эти два процесса носят название метаболизма, они связаны между собой и происходят одновременно. Для проявления метаболизма нужна энергия, которую микробы добывают окислением органических веществ, путем дыхания и брожения (энергетический обмен). Таким образом, питательные вещества расходуются для обеспечения организма энергией и для образования веществ клетки (конструктивный обмен).
Процессы питания и дыхания теснейшим образом связаны в клетке и осуществляются одновременно. Они обеспечивают проявление всех жизненных функций организма.
Откуда же клетка черпает энергию? Основное топливо — аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), которая образуется при окислении углеводов и других энергетических веществ и синтезируется в митохондриях, протоплазме и ядре. При размножении, движении и других процессах клетка расходует-потребляет энергию, запасенную в виде АТФ. Происходит распад АТФ на АДФ (аденозиндифосфорную кислоту), гораздо более бедную энергией. Важный источник энергии — углеводы, промежуточным продуктом распада которых является пировиноградная кислота. Она служит исходным продуктом во многих процессах синтеза и распада.
В клетке постоянно происходит регулирование процессов накопления и расходования энергии, что выполняет система АТФ↔АДФ. А как разнообразен механизм питания и усвоения различных веществ у микробов! Этим они резко отличаются от животных и растений. Когда человек стал синтезировать различные химические соединения (полиэтилен, пластмассы, моющие средства и др.), предполагалось, что они устойчивы к биологическому разрушению. Основываясь на этом, в одной из европейских стран были применены полиэтиленовые трубы для сооружения водопровода. Через некоторое время трубы были все же «съедены» почвенными микроорганизмами.
Разрушающая способность микроорганизмов очень велика: некоторые микроскопические грибы пластмассу «поедают» за месяц, а с металлом могут справиться за полгода. Поэтому защита от биологических повреждений материалов приобретает важное народнохозяйственное значение. Огромна приспособительная реакция мельчайших «невидимок» — человек синтезирует новые соединения, в природе этих соединений никогда не было и, следовательно, микроорганизмов, которые бы их быстро разрушали, тоже не существовало, но тут же возникают микробы-мутанты с новыми свойствами, они начинают образовывать ферменты, разлагающие многочисленные химические продукты. Ферменты участвуют в обмене веществ всех живых организмов, в том числе и микроорганизмов. Они обусловливают все жизненные функции клеток. Ферменты — это биологические катализаторы, обладающие способностью ускорять необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов химические реакции. Число ферментов свыше 2000, они очень специфичны (т. е. каждый фермент разлагает только определенное соединение) и чрезвычайно активны (например, 1 моль фермента сахарозы способен расщепить в 1 с 1000 молей сахарозы).
Ферменты микробов, участвующие в обмене и транспорте питательных веществ, находятся в цитоплазматической мембране. Многие ферменты не связаны с отдельными структурами клетки, а находятся в цитоплазме в растворенном виде.
Микробы настолько разнообразны по способу питания, что могут усваивать и газообразные простые элементы и сложные органические соединения. Так, некоторые микроорганизмы, подобно зеленым растениям, образуют органические вещества своего тела из неорганических, пользуясь энергией солнечного света — это фотосинтезирующие микроорганизмы. Они содержат пигменты типа хлорофилла. Хемосинтезирующие строят свою живую материю из простых минеральных соединений в результате химических реакций. Литотрофные (от греч. «литое» — «минерал», «камень») микроорганизмы осуществляет свою жизнедеятельность без органических соединений, а единственным источником углерода для них является углекислый газ. Сюда относятся водородные бактерии (окисляют водород с образованием воды), нитрифицирующие (окисляют аммиак в азотную кислоту), железобактерии (окисляют закислы железа в окислы) и бесцветные серобактерии (окисляют сероводород до серной кислоты).
Принято вес многообразие усвоения питательных веществ у микроорганизмов делить на две большие группы: «самостоятельно питающиеся» — автотрофы (от греч. «ауто» — «сами», «трофик» — «питающиеся»), они из углекислого газа воздуха строят сложные органические соединения; другие микроорганизмы нуждаются в готовых органических соединениях, их называют гетеротрофы (от греч. «гетеро» — «другой»). Весьма многочисленная группа микробов использует готовые органические соединения: белки, углеводы, спирты, органические кислоты и др. Сюда относятся самые разнообразные бактерии, грибы, дрожжи, микробы, населяющие организм человека, животных, насекомых. Они играют значительную роль в разложении органических веществ.
Микробиологи располагают рецептами определенных блюд, которые «с удовольствием» потребляют микробы. Написаны руководства, где подробно приводятся состав и способы приготовления так называемых питательных сред. В их «меню» имеются яичные, картофельные, морковные, молочные, мясные блюда, капустные и многие другие. Для определенных микроорганизмов составляют минеральные среды, куда входят аммонийные соли, соли фосфорной кислоты и т. д.
Настои сена, кукурузный экстракт, отходы картофельного производства, меласса, солодовое сусло — отличные продукты «пищевого блока», которыми располагают микробиологи при выращивании микробов. Микробы должны получать полноценную пищу, содержащую все составные части веществ, из которых они строят свою клетку, — углерод, азот, водород, кислород. Потребляемая пища должна быть легко усвояема микробной клеткой, а для этого белки должны предварительно пройти соответствующую обработку. Например, для приготовления мясных блюд прежде всего готовится «мясная вода», для чего берется мясной фарш, к нему добавляется двойной объем воды, все это настаивается сутки, затем отфильтровывается. Мясная вода содержит все питательные вещества, далее приготавливают мясной бульон, добавляя в мясную воду 0,5% соли и 1% пептона (порошка, содержащего вещества, которые составляют первый продукт распада белка). Полученную среду называют мясо-пептонным бульоном, на котором очень хорошо размножаются микробы. Другим весьма важным фактором является то, что питательные среды не должны содержать посторонних микробов, а быть стерильными. Только тогда можно вносить в них какой-либо материал (почву, воду и т. д.) для роста и обнаружения в этих объектах «невидимок». В лабораториях применяют разные способы стерилизации, например, обеспложивание, т. е. уничтожение всего живого.
Самый простой способ — стерилизация нагреванием, т. е. уничтожение микробов термической обработкой. Жидкости чаще всего стерилизуют в особом аппарате — автоклаве, где нагретый пар под давлением в 0,5—1, 1,5—2 атм свертывает белки микроорганизмов и тем самым вызывает гибель всех микробов, даже их спор, кстати очень устойчивых. Стерилизацию в автоклаве проводят в течение 20—30 мин.
Питательные среды, содержащие сахара, молоко, картофель, стерилизуют текучим паром в кипятильнике Коха при температуре 100°С в течение часа. Обычно для уничтожения всех микробов, образующих споры, применяют трехкратную или дробную стерилизацию. В пищевой промышленности широко используют пастеризацию — это прогрев при температуре 60—70°С в течение 15 мин различных продуктов: вина, пива, молока. При пастеризации погибают многие патогенные микроорганизмы, которые не образуют спор (туберкулезная палочка, возбудители острых желудочно-кишечных заболеваний и др.).
Все мы покупаем в магазинах молоко, кефир, которые обработаны методом пастеризации, а потому их можно употреблять без кипячения при обязательном хранении в холодильнике. Стерилизуют продукты фильтрованием с помощью ультрафильтров или бактериальных фильтров, приготовленных из стекла, керамики, асбеста и других материалов. В настоящее время чаще используют мембранные фильтры из нитроцеллюлозы. Все фильтры имеют очень тонкие поры, а потому сквозь них бактерии не проникают, но проходят вирусы.
Что собой представляет то помещение, которое именуется микробиологической лабораторией? Это своеобразный храм, где целыми днями (а порой и сутками) трудятся «охотники за микробами». Лаборатория имеет специальное оборудование, в ней много разных приборов (от простых до сложных), есть термостат где поддерживается определенная температура, в нем содержатся пробирки, колбы, в которых растут микробы. Здесь же находится сушильный шкаф, где стерилизуется стеклянная посуда для выращивания микробов. Есть «бокс» — помещение со стерильными условиями, необходимыми для манипуляций по пересевам (перенос микробов из одной пробирки в другую). Микробиолог работает в халате, в условиях полного соблюдения всех правил предосторожности контакта с патогенными микробами. В лаборатории много различной стеклянной посуды — это пробирки, колбы, пипетки, чашки Петри. Посуда, в которой будет находиться питательная среда, должна быть стерильной. Ее тщательно моют, сушат и заворачивают в бумагу, а пробирки и колбы затыкают ватными пробками, чтобы после стерилизации из воздуха в них не проникли микробы. Обычно посуду стерилизуют в автоклаве или горячим воздухом в специальных электрических сушильных шкафах при температуре 170° С в течение одного-полутора часов.
Спиртовка и бактериологическая петля — неизменная принадлежность любого микробиолога. На пламени спиртовки стерилизуют покровные и предметные стекла, прожигают пипетки, бактериологическую петлю, с помощью которой переносят микробов из одной пробирки в другую и производят высевы на питательные среды.
Велика заслуга Роберта Коха и его сотрудников в разработке методов выращивания бактерий на так называемых плотных питательных средах, содержащих агар и желатин в стерильных плоских стеклянных чашках (чашки Петри). Агар-агар — полисахарид, получаемый из морских водорослей, при добавлении его в количестве 1—2% в жидкую среду она становится плотной (он разжижается при температуре выше 100°С и застывает при охлаждении 40—50° С). После того как микробы вносятся в питательную жидкую среду или в чашки Петри на твердой среде, их помещают на 24—48 ч в специальные приборы — термостаты, где поддерживается постоянная температура в пределах 35—37° С.
Существуют микробы, поглощающие азот непосредственно из атмосферы (в воздухе содержится около 80% азота). Большинство же микробов нуждается в белковой пище, некоторые не могут обойтись без витаминов и даже без крови животных.
Есть избирательные среды для роста определенных микробов. В такой среде наиболее хорошо приспособленный к ней микроорганизм растет и вытесняет все остальные. Примеров тому много. Так, для выделения холерного вибриона (возбудителя азиатской холеры) из воды применяют 1%-ную пептонную воду щелочной реакции — этот микроб очень бурно растет в такой среде по сравнению с другими микроорганизмами.
Несложно выделить микроорганизмы, использующие окись углерода из сточных вод нефтеперерабатывающих заводов, бактерии, использующие гемоглобин из сточных вод боен и т. д.
Питательные вещества, прежде чем они смогут проникнуть через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану, подвергаются процессам разложения с помощью ферментов, выделяемых микробной клеткой. Ферменты образуются в результате жизнедеятельности клеток: они или остаются в них, стимулируя химические реакции, или же выделяются клеткой во внешнюю среду. Микроорганизмы «вырабатывают» ферменты, необходимые им для усвоения питательных веществ и получения энергии. Без ферментов нет жизни, но сами они не являются живой материей. В клетках микробов может образовываться огромное количество ферментов, что и используется человеком для получения их в промышленном масштабе.
Как переносятся питательные вещества в клетку? Эта проблема — одна из актуальных, сложных и еще недостаточно изученных. Возможны разнообразные пути. Предполагают, что в цитоплазматической мембране есть особые белковые вещества — пермеазы, которые служат как бы паромами, перевозящими питательные вещества из окружающей среды в протоплазму клетки. Поглощение веществ специфично — это значит, что поглощаются только те вещества, у которых имеются соответствующие переносчики (пермеазы).
Большую роль в питании играет углерод — важнейший биогенный элемент, он находится в связанном соединении во всех живых клетках. Микроорганизмы получают необходимую энергию при разложении сложных сахаров на простые соединения.
Микробы обладают всеми особенностями, свойственными живым организмам, при поглощении питательных веществ совершаются сложные процессы усвоения их для построения всех составных частей клетки, выработка соответствующей энергии для проявления жизненных функций — размножения, выделения тепла, образования пигментов, движения, выработки ферментов, витаминов, токсинов (у патогенных), антибиотических веществ и т. д.
Основные поставщики энергии — углеводы, при сгорании их происходит разложение сложных сахаров на простые соединения до конечных продуктов — воды и углекислого газа — и образуется большое количество энергии, измеряемой в килокалориях. Потребность микробной клетки в энергии обеспечивается процессами энергетического обмена, а именно расщеплением и окислением органических веществ с освобождением энергии.
Способы добывания энергии у микроорганизмов различны: одни получают ее при дыхании, другие — при брожении. Аэробы, подобно высшим организмам, дышат, получая энергию путем окисления органических веществ, и при этом используют газообразный кислород. В результате образуется весьма большое количество энергии. Например, при полном окислении 1 моля глюкозы освобождается 674 кал. Анаэробы способны жить без свободного кислорода, они получают химическую энергию, усваивают связанный кислород в процессе брожения глюкозы и других субстратов. К аэробным организмам относятся грибы, некоторые дрожжи, многие бактерии и водоросли.
Большинство микробов принадлежит к анаэробам, они способны жить без кислорода, а потому (несмотря на то, что при брожении образуется на 1 моль глюкозы 27 кал) в общем масштабе благодаря своей массе они способны выделять значительное количество энергии.
Энергия, освобождающаяся при разложении сахаров, служит не только для внутренних потребностей, часть ее излучается в виде тепла. Известно, что во влажном сене или конском навозе температура повышается и часто достигает 70° С — это происходит за счет деятельности микробов. Есть бактерии, излучающие энергию в виде зеленого или голубоватого свечения, часто такие бактерии обитают в морской воде. Свечение бывает настолько сильным, что позволяет без дополнительного освещения фотографировать эти культуры. Микробы могут вырабатывать красящие вещества самого различного цвета — черного, красного, синего, ярко-зеленого, желтого, фиолетового и др. Некоторые из этих красящих веществ являются антибиотиками (например, хлортетрациклин или красный актиномицин). В природе существует бактерия, которая образует кроваво-красный пигмент. Если она поселяется на продуктах, то образует «кровавые пятна» — это чудесная палочка Сарратея марцесценс. Появление на хлебе красных пятен вызывается развитием в мякише пшеничного хлеба бактерий Микрококкус продигиозум. Окрашивание мякиша обусловлено красящим веществом продигиозином. Оптимальная температура для развития бактерий 25° С. Поэтому в редких случаях наблюдается окрашивание мякиша пшеничного хлеба (преимущественно летом).
Микроорганизмы выделяют и различные ароматические вещества. Так, запах сливочного масла, сливок, различных сыров обусловлен деятельностью особых молочнокислых бактерий, образующих приятный аромат, Дрожжи и некоторые грибы придают винам определенный букет запахов. Движение микробов также происходит как результат проявления энергии, причем очень часто скорость эта огромна. Так, извитая форма микроба Спириллюм длиной в 10 нм проплывает за секунду расстояние в 10 раз большее, чем его длина.
Микроорганизмы, как все живые организмы, способны к росту и размножению. Рост микробов подчиняется определенной закономерности и обычно представляет кривую, где в определенные фазы роста клетки обладают различными физиологическими свойствами. Типичная кривая роста представляет S-образную форму, где одна фаза роста сменяется другой в определенной последовательности.
Рост микробной клетки, как правило, прекращается, достигнув определенной величины, наступает момент размножения, когда материнская клетка делится на две половины — появляются две дочерние. Вырастая, они тоже делятся, и в результате образуется 4 клетки, потом 8, 16 и т. д. При благоприятных условиях бактерии способны к невероятно быстрому размножению. Очень быстро размножается кишечная палочка (постоянный обитатель кишечника человека, животных и насекомых) и возбудитель холеры — холерный вибрион, каждые 20 мин материнская клетка делится на две дочерние. Подсчитано, что из одной клетки через сутки возникает такое количество клеток, что из них можно было бы соорудить пирамиду с основанием в 1 км2 и высотой до 1000 м.
Если учесть, сколько клеток образуется в течение 48 ч из одной исходной клетки вибриона, то число это представит цифру 22 с 42 нулями, а общая масса в тоннах цифру 22 с 24 нулями, то есть масса в 4000 раз больше, чем масса земного шара.
Но в природе не происходит такого беспрерывного размножения микробов. Этому много препятствий, которые не могут преодолеть клетки и погибают в массовых количествах, не дожив до деления. Гибель наступает от различных причин: недостаток питательных веществ, накопление вредных продуктов отброса, действие ультрафиолетового спектра прямых солнечных лучей, вредных химических соединений, дезинфицирующих средств и т. д. Многие микробы враждуют между собой и в борьбе за жизнь побеждают сильные, устойчивые, основная же масса их погибает.
Жизнь микробов зависит и от температуры окружающей среды. Обычно наиболее благоприятная для большинства микробов температура в пределах 25—37°С. Для всех возбудителей инфекционных заболеваний оптимальная температура 37° С, максимальная 42—45°С и минимальная 12—30°С. Некоторые болезнетворные микроорганизмы остаются живыми в течение нескольких дней при 190° С. Описаны случаи, когда бактерии выдерживали на протяжении нескольких часов охлаждение до —270° С. Споры возбудителя сибирской язвы способны выдерживать полминуты температуру 400° С. По отношению к температуре микробы принято делить на 3 группы: психрофилы — холодолюбивые, мезофилы (предпочитающие средние температуры), термофилы (любители высокой температуры). Психрофилы обычно обитают в холодных водных источниках, в северных морях и глубоких озерах, сюда же относятся микроскопические водоросли, которые развиваются на снегу и окрашивают его в кроваво-красный цвет. Многие светящиеся бактерии живут в морских глубинах и растут при 5—10° С. Мезофильные микроорганизмы — это в большинстве своем бактерии — сапрофитные и патогенные формы; оптимальная температура для них 28—37° С. Очень интересную группу составляют термофилы, они обнаруживаются в почве, торфе и навозе, иле, горячих минеральных источниках Камчатки, Курилов. Есть микробы, великолепно чувствующие себя при 80—90° С и даже выдерживающие температуру 93° С.
Как могут развиваться живые клетки при такой высокой температуре? Возможно, они являются предками тех микробов, которые существовали в период преобладания на земном шаре повышенных температур? В последние годы выяснено, что большинство ферментов термофилов не разрушается при 79° С. Многие загадки еще предстоит разрешить ученым, чтобы объяснить удивительную особенность «невидимок».
Микробы погибают чаще от высоких температур, которые вызывают свертывание белка их протоплазмы, и клетка перестает существовать.
Низкие температуры менее губительны, но быстрая смена температур плохо переносится микроорганизмами, зачастую они ее не выдерживают. Попеременное нагревание и охлаждение приводит к уничтожению значительного числа микробов. Очень устойчивы к температуре споры: чтобы уничтожить их, действуют насыщенным водяным паром при 120° С в течение 20—30 мин (в автоклаве). Человек в повседневной своей жизни для уничтожения микробов применяет высокие температуры: при консервировании фруктов, овощей и т. д. В медицине кипятят инструменты, шприцы, иглы при различных лечебных процедурах.
Микробы устойчивее других живых организмов к радиации, но от ультрафиолетовых лучей они погибают. Немаловажное значение в жизни микробов имеет «реакция» среды (pH), в которой могут находиться клетки. Каждый микроорганизм развивается только в определенных пределах pH. Если концентрация водородных ионов не будет подходящей, развитие задерживается и в конечном итоге клетка гибнет, все это учитывается при изучении и выращивании определенных микробов. Многие почвенные и водные микроорганизмы приспособились к значительным колебаниям pH, но паразитические формы, живущие в теле хозяина (человека или животных) могут расти только в определенной среде. Мы знаем, что у нейтральной среды pH равна 7,0 (это обычная реакция воды); если она кислая, величина pH будет ниже 7,0, а если щелочная — выше 7,0.
Возбудитель холеры растет в щелочной среде (pH = 8,2), а в кислой он гибнет через несколько минут; мелкие грибы растут в кислой среде (pH = 6,5). Кислотоустойчивые бактерии выдерживают очень кислые среды (например, возбудитель туберкулеза). Насколько среда насыщена кислородом, обозначают символом rH2, это тоже существенный фактор, влияющий на размножение клеток. Потребность микроорганизмов в кислороде очень различна. Большое значение для дрожжей имеет присутствие в среде кислорода. Так, при недостатке кислорода в процессе брожения образуется спирт, а в присутствии кислорода происходят окислительные реакции, в результате которых образуется углекислый газ и вода.
Как уже говорилось, микробная клетка содержит значительное количество воды в связанном и свободном состоянии. Для продолжения жизни необходима определенная влажность той среды, где живут клетки, поскольку все жизненные биохимические реакции возможны только в водной среде.
Микробы, а особенно их споры, хорошо переносят обезвоживание, в этом случае замедляются все процессы метаболизма и наступает состояние анабиоза — что-то наподобие зимней спячки медведей и некоторых других животных и насекомых. В природе микробы часто подвергаются обезвоживанию, особенно в зимнее время в результате замораживания. В практике человек применяет высушивание для консервирования грибов, ягод, плодов, различных лекарственных трав.
Осмотическое давление внутри клеток бактерий велико, оно равно нескольким атмосферам. Рост микроорганизмов наблюдается только при определенной концентрации питательных веществ. При повышенной концентрации, например, хлористого натрия клетка обезвоживается, вода выходит из клетки, протоплазма сжимается и наблюдается явление плазмолиза, клетка сморщивается и погибает. При пониженной концентрации соли происходит обратное явление — вода поступает в протоплазму, она набухает и оболочка лопается, в результате клетка разрушается. Как уже упоминалось, губительно действует на микробы прямой солнечный свет, особенно его коротковолновая часть — ультрафиолетовые лучи. Все мы знаем, что проветривание помещения в солнечный день приводит к гибели микробов, находящихся в помещении. Ультрафиолетовые лучи используют в «бактерицидных» лампах, которыми оснащают операционные помещения и «боксы».
Но существует особая группа бактерий (пурпурные серобактерии, обладающие способностью фотосинтеза) и некоторые грибы, которым свет необходим.
Ионизирующие излучения; γ-, α-, β-лучи и рентгеновы лучи на микроорганизмы действуют значительно слабее, чем на людей, животных, растения. Некоторые микробы переносят дозу в 1 млн. рентген, тогда как все живое при таком облучении превращается в прах. В ряде случаев ионизирующие излучения применяют для стерилизации некоторых пищевых продуктов.
Микроорганизмы обычно способны выдерживать давление в 5 и даже 10 атм. В морской воде, где концентрация солей достигает 3,5% (что соответствует давлению в несколько десятков атмосфер), находятся микроорганизмы, называемые галлофилами. Они обнаружены в Мертвом море, вода которого содержит 25% соли. Другие микробы могут существовать в средах с высоким содержанием сахара: в меде, сахарных сиропах и т. д. Так, в меде встречаются дрожжи, способные жить при концентрации сахара 70—80%.
Если человек может выдержать повышение давления до 4 атм, а водолазы до 8, то микробы давление в 1000 атм выносят без изменения жизненных функций. Интересны сообщения о том, что клетки дрожжей выживали при давлении 8000 атм, а споры одной бациллы выдерживали 20 000 атм в течение 45 мин.
Многие химические вещества действуют на микробы губительно: это 1%-ная бромная вода, 1%-ная сулема, этиловый спирт, йод, фенол, формальдегид и др.
Для консервирования мясных и рыбных продуктов прибегают к копчению: в коптильном дыму содержатся фенол, креозот, формальдегид, уксусная и муравьиная кислоты, что препятствует развитию микробов. Антимикробным действием обладают многие лекарственные соединения (сульфамидные препараты) и антибиотические вещества, продуцируемые некоторыми бактериями. Несмотря на способность микробов к необычайному росту и размножению, в природе много моментов, подстерегающих и уничтожающих живые клетки, поэтому наша планета и не погрузилась в микробную массу. Микробы — отличные санитары, они способствуют очищению от органических остатков земной поверхности.
Как же размножаются микробы? Ведь если мы возьмем одну микробную клетку и поместим ее на твердую питательную среду, то через сутки на чашке Петри образуется колония, представляющая собой миллионы клеток, являющихся потомками одной клетки. Способов размножения у микробов много, один из самых распространенных — простое деление клетки пополам, которому предшествует репликация (удвоение) ДНК бактериальной хромосомы, процесс протекает сложно с участием определенных генов. Из исходной молекулы ДНК образуются дочерние, которые состоят из одной родительской и одной вновь синтезированной цепи ДНК.
Некоторые бактерии размножаются почкованием, когда на материнской клетке образуется бугорок: он разрастается в дочернюю клетку. Существует и половой способ размножения, когда наблюдается слияние мужской и женской особей. Скорость размножения у микробов необыкновенна, за сутки сменяется столько поколений, сколько у человека за пять тысяч лет. Эта особенность помогает им сохранить свое существование, несмотря на массовую гибель при наступлении неблагоприятных условий.