До недавнего времени предполагалось, что вклад азота в почву симбиотическими клубеньковыми бактериями значительно выше, чем несимбиотическими азотфиксаторами, последние связывали лишь около 3—5 кг азота на 1 га в год.
Сейчас установлено, что для почв умеренного климата свободноживущие азотфиксаторы связывают 25—94 кг/га азота в год (Мишустин, 1979; Рыжова, Умаров, 1979), а для почв тропических районов — 90—600 кг/га (Дарт, Дэй, 1979).
Активность азотфиксации коррелирует с фазой развития растений: усиление ее начинается с момента появления проростков растений, достигает максимума к периоду цветения и резко снижается после уборки урожая (Калининская и др., 1977; Мешкова, 1979). Активность несимбиотической азотфиксации связана и с суточной периодичностью. Она максимальна в дневные часы, когда происходит активная транспортировка энергии фотосинтеза в прикорневую зону в виде корневых выделений (полисахаридов, в состав которых входят глюкоза, галактоза, галактуроновая кислота, манноза и др.). С помощью высокочувствительного ацетиленового метода определения азотфиксирующей активности была выявлена способность к несимбиотической азотфиксации почти у всех почвенных бактерий (сульфатредуцирующих, метанобразующих, метанокисляющих, фотосинтезирующих и др.), среди которых есть как гетеротрофы, так и автотрофы, аэробы и анаэробы, грамотрицательные и грамположительные. В последние годы к хорошо известным свободноживущим азотфиксаторам таким, как азотобактер, клостридиум, Beijerinckia, отнесены еще гетеротрофные: Bacillus, Desulfovibrio, Corynebacterium, Arthrobacter, Hydrogenomonas, Mycobacterium, Pseudomonas, Spirillum, Deria и др. (Умаров, 1979).
Способность эукариотных организмов, например грибов фиксировать атмосферный азот окончательно не установлена, в настоящее время много внимания уделяется изучению состава и свойств сообществ азотфиксирующих микроорганизмов поскольку микроорганизмы в почве развиваются не в чистой культуре, а тесно ассоциируют с другими организмами; установлено, что присутствие других микроорганизмов стимулирует азотфиксацию.
Микроорганизмы-азотфиксаторы выделяют разнообразные метаболиты, в первую очередь аминокислоты, которые могут поступать в ризосферную зону; после отмирания клеток микроорганизмов, в результате аммонификации белков и других азотсодержащих соединений весь фиксированный азот поступает в почву. Азотфиксирующие микроорганизмы могут быть одновременно и денитрификаторами, если в почве имеется избыточное количество легкодоступных соединений азота, но, как только их концентрация снижается, они снова фиксируют атмосферный азот.
Бактерию, фиксирующую молекулярный азот, впервые удалось выделить С. Н. Виноградскому в 1893 г. Это Clostridium — Pasteurianum — спорообразующая анаэробная палочка, подвижная (имеет перетрихиальное жгутикование). Бактерии рода Clostridium обычно развиваются в верхних слоях почвы, богатых органическим веществом в широком диапазоне pH — 4,5—9. Такая способность выявлена у многих других представителей этого рода: Cl. butyricum, Cl. pectinovorum, Cl. beijerinckia и др. Самый активный среди них — Cl. Pasteurianum, фиксирующий 5—10 мг азота на 1 г источника углерода. В качестве последнего они используют моносахариды, полисахариды, органические кислоты. Хорошо переносят высокую влажность, так как по природе своей анаэробны, усваивают не только молекулярный азот, но и другие минеральные и органические азотсодержащие соединения. По отношению к температуре среди них есть мезофилы и термофилы. Споры клостридиев могут выдерживать нагревание до 80° С. Накопление азота в почве благодаря деятельности этих организмов незначительно — несколько килограммов на 1 га за период вегетации.
В почве широко распространены свободноживущие азотфиксаторы семейства Azotobacteriaceae. К ним относится выделенная в 1901 г. голландским микробиологом М. Бейеринком аэробная гетеротрофная Azotobacter chroococcum. Клетки азотбактера крупные — 1—10 мкм, изменчивой формы — от шарообразной до палочковидной, обычно окружены слизистыми капсулами, на разных стадиях развития подвижность их изменяется, иногда превращаются в цисты. Существует еще несколько видов азотобактера, из которых наиболее изучены: Az. vinelandii, Az. beijerinckii, Az. aglophillum. Это мезофилы с оптимумом развития 25—30° С, продуценты биологически активных веществ: витаминов группы В, биотина, гетероауксина, гибереллина, ауксинов, а также антибиотических противогрибковых веществ. В качестве источников углерода лучше всего усваивают легкодоступные формы углеродсодержащих 0рганических соединений. Поскольку запас подвижного органического вещества в почве невелик, развитие азотбактеров часто ограничено. Кроме азота атмосферы они могут получать его из различных минеральных и органических азотсодержащих соединений. При отсутствии связанных форм азота азотобактер фиксирует молекулярный азот в количестве 15—20 мг азота на 1 г органического вещества. Все виды очень чувствительны к содержанию в почве фосфора, кальция и некоторых микроэлементов (особенно молибдена). Обладая высокой гидрофильностью, они широко распространены в пресных водоемах, илах, сточных водах, затопляемых рисовниках, увлажненных почвах, на растениях прудов и водоемов. Предполагается, что предки морских и почвенных видов азотобактера были общими.
Близкими к азотобактеру по многим физиологическим свойствам оказались бактерии рода Beijerinckia, выделенные из кислых почв рисовых полей Индии; в отличие от азотобактера они обладают высокой кислотоустойчивостью (развиваются при pH 3), кальциефобы, хорошо переносят повышенные концентрации железа, алюминия. Фиксируют от 16—20 мг азота/г ассимилированного углерода. Бактерии этого рода встречаются в основном в почвах южной и тропической зоны, обнаружены на поверхности листьев тропических растений в Индонезии. Основную роль в балансе азота они играют в кислых почвах (красноземах, латеритах).
Фиксацию атмосферного азота осуществляют и лишайники, представляющие собой сложный симбиотический организм, состоящий из гриба, водорослей и бактерии (Генкель, Плотникова, 1973). Последние представлены родами Azotobacter и Beijerinckia. Они могут усваивать азот воздуха в количестве от 4,6 до 6,7 мл/г маннита.
Такой способностью наделены также многие синезеленые водоросли из отдела Cyanophyta. Лабораторные опыты показали, что водоросли, имеющие толстые слизистые влагалища (носток, ридулярия, глеокопса и др.), хорошо растут в растворах, не содержащих даже следов связанного азота. Прямыми определениями азотистых соединений в органическом веществе таких культур был обнаружен N (который мог ассимилироваться лишь из атмосферы). Клетки синезеленых водорослей окружены слизистой капсулой; разделившись, они покрываются общей слизистой оболочкой, получается скопление Клеток, погруженных в бесцветную слизь, иногда оно достигает таких размеров, что обнаруживается простым глазом в форме окрашенных в зеленый или сине-зеленый цвет комочков. Внутри слизистых капсул на органическом субстрате живут Разнообразные микроорганизмы, преимущественно бактерии, среди них азотобактер, много клостридий, связывающих атмосферный азот. В данном случае наблюдается симбиоз фототрофа — водоросли с литогетеротрофами-азотфиксаторами.
В чистых культурах способность к азотфиксации была установлена у 40 видов этих водорослей — обитателей водоемов и скальных пород. Они фиксируют от 12 до 26 кг/га, на рисовых полях — 20—25 кг/га азота за вегетационный период. Накопление азота водорослями во всех экосистемах на территории СССР составляет около 0,5 млн. т в год (Мишустин, Понкратова, 1974).