Определение родовой, видовой и таловой принадлежности микроорганизмов на основании изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и антигенных свойств — наиболее ответственная часть микробиологического исследования.
Большое количество патогенов, принимающих участие в возникновении инфекционного процесса, обусловливает применение различных тестов по определению ферментативных свойств путем постановки большого количества биохимических реакций, что позволяет в комплексе с другими данными определить вид микроорганизма. Этот наиболее трудоемкий процесс выполняется в несколько этапов, требует большого количества дифференциально-диагностических сред, реактивов, посуды, что значительно удорожает стоимость анализа и удлиняет сроки его проведения. Результаты удается получить через 4…7 сут. Поэтому для идентификации микроорганизмов наиболее перспективны микрообъемные коммерческие тест-системы (МТС). Они избавляют практических бактериологов от трудоемких и дорогостоящих процедур и позволяют получать стандартные, сопоставимые, воспроизводимые данные, экономят реактивы, ускоряют выдачу результата анализа.
Коммерческие тест-системы для биохимической идентификации микроорганизмов различных групп представляют собой готовые к использованию полистироловые планшеты и панели с сухими дифференцирующими средами или субстратами, которые выпускаются разными производителями.
Коммерческие тест-системы на основе полистироловых планшетов. В Российской Федерации наибольшее распространение получили следующие тест-системы.
1. Микротест-системы (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала) для идентификации микробов. Они представляют собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из 12 одинаковых ячеек, которые содержат сухие питательные среды с различными углеводами, многоатомными спиртами, аминокислотами, солями неорганических кислот и индикатором pH, стабилизированные поливиниловым спиртом. Перечень выпускаемых МТС для идентификации микроорганизмов, имеющих ветеринарное назначение, включает в себя МТС-М-12Е (биохимическая идентификация энтеробактерий), МТС-5У (определение ферментативной активности энтеробактерий), МТС-С (биохимическая идентификация стафилококков), МТС-Стреп (биохимическая идентификация стрептококков), МТС-Л (биохимическая идентификация листерий), МТС-Сальм (биохимическая идентификация сальмонелл).
2. МТС («Плива-Лахема», Чехия) для биохимической идентификации энтеробактерий (ЭНТЕРО-тест 16; ЭНТЕРО-тест 24; ЭНТЕРО-скрин; ЭНТЕРО-Рапид 24), для энтерококков (ЭН-коккус-тест), стафилококков (СТАФИ-тест 16), стрептококков (СТРЕПТО-тест 16), анаэробов, выделенных из пищевых продуктов и кишечника (АНАЭРО-тест 23), бактериальной бета-лактамазной активности (бета-ЛАКТАМ-тест).
3. Одноразовые диагностические пластины (НПО «Диагностические системы», НИИЭМ, г. Нижний Новгород) ПБДБ (для идентификации энтеробактерий) и ПБДС (для идентификации стафилококков).
4. Системы на основе стандартных 96-луночных микротитровальных планшетов для идентификации энтеробактерий (ММТ-Е1 и ММТ-Е2) (Ставропольская государственная медицинская академия).
5. Наборы для ускоренной (в течение 5 ч) идентификации энтеробактерий РапидЭнтеро 200 и РапидЭнтеро 750 (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург).
Помимо вышеперечисленных используют и зарубежные диагностические системы для идентификации различных микроорганизмов в течение 3…48 ч: API, ID (Bio Merieux, Франция), BBL Crystal (Becton Dikinson), «MicroScan» (Dade, США), MicroTax (Sy-Lab, Австрия).
Диагностические полоски и диски для биохимической идентификации микроорганизмов. Системы индикаторные бумажные (СИБ) представляют собой полоски или диски из хроматографической бумаги, пропитанные соответствующим субстратом и индикатором и покрытые для стабилизации водным раствором поливинилового спирта.
Реакцию ставят, как правило, пробирочным методом. В пробирку помещают 0,3 мл физиологического раствора или мясопептонного бульона, затем туда вносят петлей колонию изучаемого микроба и соответствующий диск. Учет реакции через 4…5 ч по изменению цвета бумажного диска. Срок годности СИБ составляет 1 год. СИБ для идентификации энтеробактерий производит НПО «Диагностические системы» (НИИЭМ, г. Нижний Новгород), коммерческие наборы СИБ для ускоренного определения колититра воды — ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала). СИБ по сравнению с МТС гораздо дешевле, зато работа с ними требует больше труда и времени.
Могут быть использованы как дополнительные к планшетным, так и самостоятельно в качестве идентификационных диагностические полоски («Плива-Лахема» производит семь типов). Диагностические полоски представляют собой пластмассовые полоски, на одном конце которых наклеена полоска индикации из фильтровальной бумаги, содержащей субстрат для выявления бактериального фермента или метаболита. В зависимости от типа полосок бактериальную культуру или наносят непосредственно на зону индикации полоски, или ее опускают в пробирку с исследуемой бактериальной суспензией и выращивают в течение определенного времени. Перечень выпускаемых диагностических полосок включает в себя: 1) ОКСИ-тест (для выявления бактериальной цитохромоксидазы); 2) ОНР-тест (для обнаружения β-галактозидазы); 3) ГИППУРАТ-тест (для обнаружения способности бактерий гидролизовать гиппурат натрия, а также для предварительной идентификации стрептококков группы B и Campylobacter jejuni); 4) ПИРА-тест (для быстрого выявления активности фермента пирролидонилариламидазы), а также для дифференциации энтерококков (тест положительный) от стрептококков (за исключением S. pyogenes); 5) ВП-тест (для постановки реакции Фогэс—Проскауэра за 2…4 ч).
Помимо диагностических полосок можно использовать также диагностические диски («Плива-Лахема»), позволяющие проводить простую селективную изоляцию и дифференциацию бактерий прямо на питательной среде. Диски из фильтровальной бумаги содержат определенные концентрации высушенных реагентов для выявления специфической бактериальной активности.
1. Диски с бацитрацином (10 ЕД). Применяют для селективной изоляции Haemophilus spp. при первичном культивировании. Тест основан на устойчивости Haemophilus spp. к высоким концентрациям бацитрацина по сравнению с сопутствующей флорой и саттелитного роста микроорганизмов этого рода в зоне диффузии экзогенных факторов роста из культуры S. aureus.
2. Диски с бацитрацином S. Предназначены для предварительной индикации β-гемолитических стрептококков группы А (S. pyogenes). Тест основан на высокой чувствительности S. pyogenes к незначительным концентрациям бацитрацина (0,04 ЕД), обеспечивающей образование зон задержки роста вокруг диска. Другие β-гемолитические стрептококки резистентны к таким дозам или образуют незначительные зоны ингибиции роста.
3. Диски с оптохином. Предназначены для рутинной первичной индикации S. pneumoniae и дифференциации их от других зеленящих стрептококков. Принцип теста основан на избирательной чувствительности пневмококков к оптохину и резистентности к нему других зеленящих стрептококков.
Общие правила работы с МТС. Методика проведения микробиологических исследований с использованием МТС должна полностью соответствовать прилагаемой инструкции. Общая схема работы с тест-системами состоит из следующих этапов.
1. Выделение культуры. Для работы с МТС используют только чистые культуры. При их выделении особое внимание следует уделять качеству питательных сред. От этого зависит видовой состав изолированных микроорганизмов, их количество в исследуемом материале и успех идентификации. По результатам первичного посева и микроскопии проводят дифференциацию культур на грамположительные и грамотрицательные кокки и палочки.
2. Приготовление бактериальной суспензии. Суспензию готовят в рекомендованной суспензионной среде из чистой 18…24-часовой культуры определенной степени мутности согласно инструкции. Использование слишком густой или жидкой суспензии может привести к ложным результатам. Параллельно делают контрольный высев взвеси культуры на кровяной агар для проверки ее чистоты, ростовых свойств и (или) для постановки дополнительных тестов.
3. Инокуляция. Суспензию тщательно встряхивают; необходимый объем вносят в каждую лунку соответствующего ряда. После этого в определенные лунки для создания анаэробных условий добавляют по 2 капли стерильного вазелинового или парафинового масла.
4. Инкубация. Планшеты в полиэтиленовых пакетах или закрытые крышками инкубируют при 30…37 °С в течение 4…48 ч.
5. Оценка результатов. По окончании выращивания проверяют чистоту культуры по контрольному посеву. При отсутствии роста увеличивают время инкубации. Затем добавляют в определенные лунки необходимые реактивы, позволяющие визуализировать или усилить цветные реакции. Учет проводят визуально с помощью специальных таблиц, цветовых шкал и (или) цветных реакций контрольных штаммов и заносят их в бланки.
6. Идентификация. Проводят с помощью таблиц биохимической активности, индексов профилей, книг-кодов или компьютерных программ.
При окончательной идентификации учитывают дополнительную информацию (микроскопия, характер колоний, наличие гемолиза, пигментообразование, подвижность и т. д.).
При работе с тест-системами следует придерживаться следующих рекомендаций.
1. Строго соблюдать правила работы с инфицированным материалом.
2. После употребления МТС необходимо обезвреживать автоклавированием при (120+2) °С в течение 1 ч.
3. Строго соблюдать условия и сроки хранения в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к тест-системам.
4. Если культуру не удается идентифицировать, следует проверить ее чистоту и повторить исследование.
5. При отсутствии роста на контрольной чашке необходимо увеличить время инкубации.