Формирование таких гигантских образований, как яйцевые клетки, требует особых механизмов для преодоления ограниченных возможностей матричной активности генома диплоидной клетки.
Сравнение организации оогенеза у представителей разных групп животных показывает, что это ограничение обычно преодолевается интеграцией метаболической активности многих сотен и даже тысяч клеток, как половой, так и соматической природы. Проявления этого принципа кооперативности весьма разнообразны.
Хотя у некоторых групп животных оогенез идет по так называемому солитарному типу, при котором синтез желточных включений происходит непосредственно в ооците, генеральной линией эволюции оогенеза является вынесение синтеза вителлогенина, белка-предшественника желточных включений, за пределы гонады. У позвоночных с высоким уровнем синтеза вителлогенина его выработка происходит в клетках печени. Под действием гипофизарного гонадотропина в фолликулярных клетках яичника образуется эстроген, наличие которого служит сигналом для инициации синтеза вителлогенина в клетках печени. Этот предшественник желтка с током крови транспортируется в яичник, где клетки фолликулярного эпителия, по-видимому, при действии фолликулстимулирующего гормона осуществляют перенос этого белка в ооцит. У насекомых синтез вителлогенина происходит в клетках жирового тела при действии гормона, также вырабатываемого фолликулярным эпителием яичника, который, в свою очередь, стимулирован фолликулотропным гормоном, продуцируемым особым нейросекреторным органом — corpora allata. У полихет описан синтез вителлогенина в целомоцитах под действием гормона головного ганглия. Таким образом, у представителей всех трех групп билатеральных животных синтез вителлогенина происходит вне гонады. Поскольку он осуществляется негомологичными структурами, эти данные свидетельствуют о независимом, параллельном возникновении у Lophotrochozoa, Ecdysozoa и Deuterostomia внегонадного синтеза основного по своей массе белка, необходимого для оогенеза, что, безусловно, говорит о высоком адаптивном значении такой организации вителлогенеза.
Разные типы гонад и оогенеза служат одной из причин большого многообразия яйцевых клеток животных. Бросается в глаза, в частности, разнообразие форм яиц, связанное с пространственной локализацией желточных и иных трофических включений. Как правило, животные имеют эндолецитальные яйца, у которых желток сосредоточен внутри ооцита. По характеру локализации желточных включений различают изолецитальные (гомолецитальные), телолецитальные и центролецитальные яйца. Изолециталъными называют яйца с равномерным распределением желтка; телолецитальные характеризуются концентрацией желтка у одного из полюсов яйца; к центролециталъным относят такие яйца, у которых плотные желточные включения сосредоточены в центральной области, тогда как цитоплазма, свободная от включений, располагается преимущественно на периферии яйца. По количеству желтка различают алециталъные (без желтка), олиголециталъные (с малым содержанием желтка), мезолециталъные (с умеренным содержанием желтка) и полилецитальные (с большим содержанием желтка) яйца. Иногда, если желтка в яйце очень мало, как, например, в яйцах Eutheria, говорят об алециталъных яйцах, хотя в этом случае было бы точнее говорить об олиголециталъных яйцах, содержащих все же небольшое количество желтка. Тем не менее в некоторых случаях образуются действительно алецитальные — безжелтковые ооциты. Например, среди плоских червей различают две группы, каждая из которых характеризуется своеобразной стратегией энергетического обеспечения раннего развития. Одна группа (Acoela, Polycladida и др.) представлена животными с типичными эндолецитальными яйцами, у которых желток сосредоточен в ооците. У плоских червей другой группы (Tricladida, паразитические классы) ооциты лишены желтка. Развитие в этом случае обеспечивается особыми желточными клетками, которые вместе с яйцом находятся в окруженной оболочкой капсуле. В соответствии с этим плоские черви подразделяются на группу архоофора (примитивный тип с эндолецитальными яйцами) и группу неоофора с эктолециталъными яйцами. У представителей пеоофора наряду с яичником имеются особые желточные железы, продуцирующие желточные клетки. Ооцит по яйцеводу и желточные клетки по желточным протокам поступают в бурсу, где после осеменения яйцо вместе с желточными клетками окружается капсулой и далее через яйцежелточный проток выводится наружу. Естественно, указанные группы животных имеют разные программы раннего развития. Нечто похожее наблюдается у немертины Linens ruber, у которой некоторые яйца, из отложенных в коконе, служат питающими клетками и потребляются другими особями данного кокона.
В ооцитах многих животных, например у плоских, круглых и кольчатых червей, моллюсков, членистоногих, иглокожих и хордовых, в том числе у ланцетника, миног, осетровых и костистых рыб, амфибий, рептилий, млекопитающих в ходе оогенеза происходит накопление особых кортикальных гранул, которые формируются при участии элементов Гольджи. Изначально они рассеяны по всей цитоплазме, но на завершающих этапах оогенеза концентрируются в кортикальной области ооцита. Обычно это сравнительно мелкие пузырьки, диаметром до 1 мкм, но у осетровых они достигают 3-4 мкм, а у костистых рыб, у них они называются кортикальными альвеолами, даже 30-40 мкм. Кортикальные гранулы содержат разного рода ферменты, сульфомукополисахариды и другие вещества, которые играют важную роль в процессе оплодотворения.
Среди всего многообразия форм оогенеза наиболее распространенным являются диффузный, солитарный, полигеномный и гипертранскрипционный типы оогенеза. Диффузный тип оогенеза встречается у низших Metazoa. Ооциты в этом случае обладают амебоидной подвижностью и способностью к фагоцитозу. Солитарный тип оогенеза с автономным синтезом макромолекул в ооците имеет весьма ограниченное распространение. Полигеномный тип оогенеза можно рассматривать как своеобразное проявление принципа кооперативности. Для этого типа характерно подключение к формированию яйцевой клетки большого числа однотипных геномов. В ходе эволюции неоднократно и независимо возникал неполный цитокинез митотически делящихся гоний, в результате чего последние формировали синцитиальную структуру. Один из элементов синцития становился ооцитом, все остальные вспомогательными клетками. Полигеномный тип оогенеза с синцитиальными клеточными клонами, формирующимися из клеток половой линии, описан у некоторых книдарий, гребневиков, аннелид, насекомых, у отдельных видов позвоночных. Неполный цитокинез, характерный для полигеномного типа оогенеза, в процессе эволюции иногда трансформировался в эндомитоз, в результате которого возникали многоядерные ооциты. Такие полигеномные ооциты описаны у хвостатой лягушки Ascaphus truei (гладконог). У сумчатой лягушки Flectonotus pygmaeus ооциты насчитывают до 3000 ядер, из которых лишь одно становится женским пронуклеусом. Возможно образование многоядерности и в результате слияния многих ооцитов, что наблюдается, например, у аннелиды Dinophilus.
У ктенофор гонии проходят несколько циклов митотических делений с неполным цитокинезом, образуя комплекс, который состоит приблизительно из ста взаимосвязанных клеток, одна из которых становится ооцитом. Как полагают, наиболее близко лежащие к ооциту питающие клетки синтезируют желток и формируют центральную эндоплазму ооцита, тогда как находящиеся на периферии комплекса клетки участвуют в формировании эктоплазмы — поверхностного слоя ооцита.
Полигеномный тип оогенеза у дрозофилы. У многих насекомых в составе аналогичного синцития или цисты различают ооцит и вспомогательные клетки цистоциты. В литературе сохранилось историческое название этих вспомогательных клеток — «питающие» клетки, или «трофоциты» (от греч. трофос — кормящий, питающий), которое отражает устаревшее представление о главной функции этих клеток. Взаимоотношения между цистоцитами и ооцитом у разных видов насекомых варьируют. В политрофных трубочках ооцит и цистоциты образуют относительно компактный комплекс. Окруженная мезодермальным фолликулярным эпителием циста представляет собой яйцевую камеру. В телотрофных яйцевых трубочках гонады «трофоциты» занимают проксимальную область, тогда как ооцит смещается дистально, сохраняя, однако, связь со своей «питающей клеткой», поскольку цитоплазматические мостики трансформируются в удлиненные транспортные каналы. Полигеномность усиливается благодаря многократной полиплоидизации цистоцитов. Благодаря полиплоидизации в цисте дрозофилы, состоящей из диплоидного ооцита и пятнадцати полиплоидных цистоцитов, насчитывается около 7000 диплоидных эквивалентов, работающих на один ооцит.
Основная функция цистоцитов в яичнике насекомых состоит в выработке рРНК, иРНК и многих нежелтковых белков. Из цистоцитов в ооцит поступают многочисленные митохондрии. Синтез предшественника желтка — вителлогенина, однако, происходит за пределами яичника — в жировом теле, откуда транспортируется по гемолимфе и поглощается ооцитом путем пиноцитоза. У дрозофилы при мутации гена fs29 нарушается функция рецепции вителлогенина. Такие мутанты стерильны, так как в их ооцитах желток не накапливается, несмотря на интенсивный синтез его предшественника в жировом теле.
У дрозофилы оогенез начинается с асимметричного деления стволовых половых клеток (СПК), располагающихся в концевых отделах яйцевых трубочек — гермариях. Исследованиями последних лет выявляется сложная система генетического контроля, которая, с одной стороны, поддерживает коммитированное состояние стволовых половых клеток, а с другой, обеспечивает их переход к дифференциации. Поскольку принципиальная схема такого контроля представляет общий интерес для понимания процессов дифференциации коммитированных стволовых клеток, остановимся на этих данных несколько подробнее.
В результате асимметричного митоза образуются дочерняя стволовая клетка и так называемый цистобласт. Асимметричность деления СПК обусловлена наличием особых цитоплазматических структур — спект. росом. Спектросомы содержат мембранные пузырьки и скелетные мембранные белки — и β-спектрин, анкирин и HTS (HULITAISHAO). Во время митоза спектросома находится в контакте с тем полюсом митотического веретена, который обращен к базальной клетке терминальной нити. Спектросомы, связываясь с веретеном, определяют его ориентацию таким образом, что одна из образующихся при делении клеток остается в контакте с терминальной нитью, а другая отдаляется от нее. Вместе с тем спектросомы играют роль и в локализации некоторых регуляторных молекул, например циклина А.
Расхождение путей развития клеток, возникших в результате деления СПК, у дрозофилы связывают с активностью генов pumilio (рит), nanos (nos) и bag of marbles (bam). Активность гена рит необходима для поддержания линии стволовых клеток. Связывающийся с РНК белок Pum служит фактором репрессии трансляции и, видимо, избирательно подавляет трансляцию некоторых РНК уже коммитированной стволовой клетки, препятствуя, таким образом, началу ее дифференциации. Переход к дифференциации коррелирует с резким снижением уровня Pum. Ген nos необходим для дифференциации цистобластов. Переход от СПК к цистобласту сопровождается существенным увеличением содержания белка Nos. В процессе переключения СПК на путь дифференциации важную роль играет также ген bam., мутации которого закрывают путь дифференциации клеток половой линии Значительные количества белка Ват характерны для цистобластов и цистоцитов, что существенно отличает их от стволовых клеток.
Асимметричность делений СПК определяется и сигналами, исходящими из соматических клеток гонады. Так, уничтожение лучами лазера апикальной части терминального филамента дрозофилы увеличивает частоту делений СПК. Как выясняется, участие клеток терминального филамента в регуляции делений СПК обусловлено активностью генов piwi и fs(l)Yb (Yb). В отсутствии этих генов стволовые клетки не сохраняются. По-видимому, путь, контролируемый геном Yb, специфичен для женских гонад, тогда как ген piwi необходим для поддержания линии СПК в гонадах обоих полов.
Важную роль в сохранении линии СПК, вероятно, играет и белок Dpp (гомолог ВМР2/4), кодируемый геном dpp (decapentaplegic). Показано, что сигнал Dpp вырабатывается соматическими клетками, окружающими СПК. Впрочем, не исключено, что Dpp может быть и паракринным фактором дифференцирующихся половых клеток или даже аутокринным фактором, вырабатываемым самими стволовыми клетками.
Хотя цистобласты и сохраняют способность к митотическим делениям, последние характеризуются неполным цитокинезом, благодаря чему между образующимися клетками сохраняются цитоплазматические мостики, или кольцевые каналы. У дрозофилы в результате четырех делений цистобласта образуется циста из шестнадцати клеток. При этом две клетки цисты — проооциты имеют по четыре кольцевых канала, соединяющих их с соседними клетками. Одна из этих клеток становится оошггом, тогда как остальные 15 оогоний превращаются в полиплоидные цистоциты.
Необходимым условием развития ооцита дрозофилы является экспрессия гена Bicaudal-D (Bic-D). Мутация Bic-D ведет к стерильности самки, поскольку в этом случае все 16 клеток цисты развиваются как цистоциты. Локализация иPHKBic—D в будущем ооците зависит от активности гена egalitarian (egl), мутация которого также вызывает стерильность. Незадолго до вителлогенеза иРНКBic—D транслируется, и образующийся белок после фосфорилирования приобретает свойства фактора, который обеспечивает дифференциацию ооцита. В случае мутации гена Bic-D возникает дефектный белок Bic-D, который не способен к фосфорилированию. Вследствие этого необходимый для дифференциации фактор не образуется, и развития ооцита не происходит.
Суммарный гаплоидный эквивалент цистоцитов составляет более 14000 С. С учетом того, что гаплоидный набор хромосом дрозофилы содержит примерно 250 рибосомных генов, в яйцевой камере имеется около 3,8·106 рибосомных генов, работающих на обеспечение одной яйцевой клетки. Благодаря этому за трое суток оогенеза в ооците запасается до 160 нг рРНК. Интересно, что количество рРНК может быть фактором, ограничивающим скорость оогенеза у дрозофилы. Так, в случае мутации bobbed, при которой происходит делеция разных участков кластера рибосомных генов, продолжительность оогенеза зависит от числа оставшихся рибосомалъных генов: при наличии 1/3 нормального содержания рДНК оогенез продолжается почти в три раза дольше (206 час вместо 75). Благодаря такой задержке зрелые яйца самок bobbed содержат нормальное количество рРНК.
Кроме рРНК в цистоцитах под контролем материнских генов (гены материнского действия) синтезируются иРНК, которые после оплодотворения яйца обеспечивают морфогенетически значимой информацией процесс раннего эмбриогенеза. Хромосомы ооцита у дрозофилы инактивированы. Эта инактивация, впрочем, не обязательна при полигеномном оогенезе. У некоторых насекомых, например у комаров, жуков и полужесткокрылых, геном ооцита активно участвует в создании пула разных типов РНК. В ооцитах жука-плавунца Dytiscus, долгоножки Tipula (Diptera), Chrysopa (Neuroptera) происходит амплификация генов рРНК. Амплифицированная ДНК сконцентрирована в виде небольшого тельца, которое располагается в ядре ооцита, но отсутствует в ядрах цистоцитов. У Dytiscus ДНК-содержащее тельце несет около 3·106 амплифицированных генов рРНК.
Перемещение РНК и белков из цистоцитов в ооцит обеспечивается механизмами внутриклеточного транспорта. Полагают, что перемещению макромолекул может способствовать электрический градиент (1 В/см), который устанавливается в системе цистоциты — ооцит. На завершающих этапах оогенеза содержимое цистоцитов транспортируется в ооцит благодаря сократительным движениям этих клеток.
Полигеномный принцип организации оогенеза обеспечивает высокие скорости формирования яиц. Продолжительность оогенеза у дрозофилы, где на каждый ооцит приходится 1,4·104 гаплоидных геномов, составляет всего 3-5 дней. У сверчка с его паноистическим типом оогенеза, при котором цистоциты отсутствуют и формирование ооцита обеспечивается всего четырьмя гаплоидными эквивалентами, оогенез продолжается более трех месяцев. Нельзя не отметить, что паноистический способ оогенеза характерен для прямокрылых (Orthoptera) и стрекоз (Odonata), т. е. для наиболее примитивных отрядов подкласса Настоящих насекомых.
Гипертранскрипционный тип оогенеза с участием хромосом типа ламповых щеток. Природе известен и другой путь существенной интенсификации метаболических процессов, необходимых для формирования яйцевых клеток. Этот путь характерен для вторичноротых. Здесь не происходит превращения части половых клеток во вспомогательные. Вителлогенин и в этом случае синтезируется вне гонады. Однако интенсивное накопление в яйце разных форм РНК обеспечивается благодаря функциональному и структурному видоизменению хромосом самого ооцита, создающему предпосылки максимальной продуктивности транскрипции. Подобный тип организации оогенеза мы будем называть гипертранскрипционным.
Впервые такие видоизмененные хромосомы были описаны в 1882 году В. Флеммингом в ооцитах тритона, а в 1892 году они были подробно исследованы И. Рюккертом в ооцитах акулы. Поскольку эти хромосомы имеют большое число боковых петель ДНК, которые на микроскопических препаратах имеют вид отростков, расположенных на центральной оси, Рюккерт назвал их «ламповыми щетками», подразумевая их сходство с «ершиком», использовавшимся в те далекие времена для очистки стекол керосиновых ламп.
Хромосомы типа ламповых щеток появляются в профазе мейоза. Они представляют собой биваленты, т. е. спаренные в области хиазм гомологичные хромосомы. Каждая хромосома бивалента состоит из двух дуплексов конденсированной ДНК. Каждый дуплекс ДНК образует многочисленные симметричные петли, образованные идентичными последовательностями. Боковые петли деконденсированной ДНК служат местом интенсивного синтеза РНК. У гомозиготных животных каждый активный локус представлен четырьмя петлями (по две на каждом гомологе). Локализация некоторых крупных петель и их форма может иметь специфический для вида характер. Число петель и единиц транскрипции хромосомы не совпадает, так как одна петля может содержать более одной единицы транскрипции. Расправление (спрединг) хромосом по Миллеру сделало возможным визуализацию транскрипции в электронном микроскопе. В результате была обнаружена исключительно высокая плотность молекул РНК-полимеразы на петле ДНК. В хромосомах типа ламповых щеток расстояние между последовательно расположенными молекулами РНК-полимеразы составляет 100-200 нуклеотидов. Такая плотная посадка полимераз предопределяет высокую продуктивность транскрипции. Действительно, в ооците с хромосомами типа ламповых щеток, где одна молекула РНК-полимеразы приходится на 102 нуклеотидов ДНК, в 1 мин производится 2 пг РНК. В соматических же клетках, где одна молекула РНК-полимеразы приходится примерно на 104 нуклеотидов нити ДНК, за такое же время синтезируется всего 0,015 пг РНК.
Продукты транскрипции после сплайсинга и полиаденилирования экспортируются в цитоплазму ооцита. До 80% иРНК в цитоплазме образует комплексы с белками секвестрации, которые инактивируют иРНК. Эти запасаемые в ооците и активируемые после оплодотворения РНП-частицы были названы А. Спириным информосомами (1966).
Синтез рРНК при гипертранскрипционном оогенезе происходит в ооците или в фолликулярных клетках. У рыб и амфибий имеет место многократная репликация ДНК рибосомных генов, или амплификация (от англ. amplification — увеличение) рДНК. У Xenopus в результате амплификации количество рДНК в ооците увеличивается примерно в 1000 раз. Амплификация начинается на стадии гоний и достигает пика на стадии пахитены. Амплифицированные гены рРНК образуют многочисленные экстрахромосомные ядрышки.
Оогенез с участием хромосом типа ламповых щеток имеет очевидные адаптивные преимущества. Благодаря постоянному обновлению иРНК создаются предпосылки длительного поддержания жизнеспособности яйцевой клетки, находящейся в яичнике. Это позволяет при неблагоприятных условиях избегать обязательной откладки яиц сразу же после завершения оогенеза.
Своеобразный характер приобретает принцип кооперативности в оогенезе птиц и рептилий. У рептилий синтез рРНК осуществляется грушевидными клетками фолликулярного эпителия. На определенном этапе своего развития грушевидные клетки соединяются с ооцитом, образуя цитоплазматический мостики. Если у насекомых с полигеномным типом оогенеза функцию поставщика рРНК выполняют цистоциты, которые представляют собой видоизмененные половые клетки, то у рептилий аналогичную функцию выполняют соматаческие фолликулярные клетки. Если в первом случае цитоплазматические мостики, через которые транспортируется рРНК, образуются вследствие неполного цитокинеза при делении гоний, то у рептилий они, по-видимому, образуются при слиянии мембран половой и фолликулярной клеток. В каждом фолликуле ящерицы насчитывается до 10 000 грушевидных клеток.
У птиц синтез рРНК, которая поставляется в ооцит, также происходит в клетках фолликулярного эпителия. Однако транспортным средством для доставки рРНК в ооцит здесь служит особая органелла — трансосома. Фолликулярные клетки образуют длинные отростки, которые погружены в цитоплазму ооцита. Концевые отделы этих отростков, в которых накапливаются большие количества рРНК, отшнуровываются от фолликулярной клетки. После разборки мембран рРНК из трансосомы поступает в цитоплазму ооцита.