До сих пор о кроссинговере, произошедшем в профазе мейоза, мы судили по подсчету кроссоверных особей (зигот) — рекомбинантов, считая, что появление их отражает соотношение кроссоверных и некроссоверных гамет.
Мы вынуждены были это делать, так как имели дело с диплоидными организмами.
Для прямого доказательства соответствия рекомбинантных зигот кроссоверным гаметам необходимо определять результаты кроссинговера непосредственно по гаплоидным продуктам мейоза. При этом гаплоидные элементы (гаметы или споры) должны быть помечены генами, проявляющими свое действие в гаплофазе. Объектом, на котором удалось осуществить подобную работу, явился плесневый хлебный гриб (Neurospora crassa), имеющий 7 групп сцепления.
Схема жизненного цикла Neurospora crassa
У этого грибка большая часть жизненного цикла приходится на гаплофазу, а диплоидная очень короткая. Собственно диплоидной является только зигота, возникающая в результате оплодотворения. Вскоре после оплодотворения зигота приступает к мейотическому делению, которое приводит к образованию аска — сумки с гаплоидными спорами. При делениях веретено своей продольной осью совпадает с продольной осью сумки. Поэтому продукты мейоза — споры располагаются в сумке цепочкой. В мейозе протекают два обычных деления созревания и, кроме того, происходят еще одно — митотическое, в результате чего в каждой сумке образуется 8 аскоспор. В первом мейотическом делении осуществляется рекомбинация генов, а в митозе удваивается каждая из гаплоидных клеток. Поэтому в каждой сумке возникают 4 пары гаплоидных аскоспор.
Учет расщепления по аскоспорам позволяет непосредственно определять результаты расщепления и кроссинговера по продуктам мейоза. Установление в этом случае характера расщепления будет прямым доказательством того, что расщепление и кроссинговер осуществляются в мейозе. Подобный анализ, проводимый по гаплоидным продуктам мейоза, носит название тетрадного анализа.
В случае моногибридного скрещивания ожидается расщепление по гаплоидным продуктам (спорам) в соотношении 2А : 2а, т. е. на две споры с доминантной аллелью гена будут приходиться две споры с рецессивной аллелью того же гена, что соответствует расщеплению 1:1.
Расщепление по одной паре аллелей, определяющих созревание аскоспор у Neurospora
На рисунке приводится расщепление по одной паре аллелей (А и а), определяющих скорость созревания аскоспор. В асках среди восьми спор видны четыре окрашенных (А), т. е. уже зрелых, и четыре неокрашенных (а), еще незрелых споры, т. е. наблюдается расщепление 1:1. Причем порядок расположения спор в сумке может быть либо ААААаааа, либо обратный: ааааАААА; он зависит от случайного расхождения гомологичных хромосом, несущих аллели А и а, к разным полюсам в первом делении мейоза. Каждую такую аскоспору можно выделить из аска микроманипулятором в стерильную пробирку с агаризованной питательной средой и вырастить, получив соответствующие спорам мицелии.
Если в сумке обнаруживается нарушение расположения аскоспор, например ААааААаа, то это будет говорить о произошедшем перекресте между двумя несестринскими хроматидами в районе между локусом аллели а и центромерой. Здесь расположение будет зависеть от расхождения хроматид и в первом и во втором мейотическом делениях. В результате аллельная пара Аа может распределиться в сумке по спорам в следующих вариантах: ААааААаа, ааААааАА, ааААААаа, ААааааАА.
Следует обратить внимание на то, что в рассматриваемом случае перекрест происходит на участке между локусом данного гена и центромерой.
Схема различных типов поведения гомологичных хромосом при образовании аскоспор у Neurospora
Чем дальше ген а будет удален от центромеры, тем вероятнее перекрест (в том числе и двойной) и, следовательно, больше будет крассоверных асков. Если ген располагается близко к центромере, перекрест менее вероятен, но зато такой ген можно точнее локализовать. Если же перекрест произойдет между дистальным концом хромосомы и аллелью а в дистальном конце хромосомы, то кроссоверного расположения аскоспор не будет обнаружено. Указанные особенности нейроспоры дают возможность определить место гена в хромосоме по расщеплению только одной пары аллелей, что невозможно у диплоидных организмов, у которых нельзя провести тетрадный анализ.
Благодаря тому, что у гаплоидных организмов число рекомбинантных генотипов точно совпадает с числом рекомбинантных гамет или спор, мы вправе судить о перекресте хромосом, произошедшем в профазе мейоза, по числу рекомбинантов и у диплоидных организмов. Проведенный таким образом тетрадный анализ доказывает, что как менделевское расщепление, так и кроссинговер базируются на закономерностях мейоза.