Как известно, пшеничная мука содержит много углеводов: крахмала, растворимых сахаров, клетчатки и др. В процессе отмывания клейковины большая часть этих веществ удаляется с промывной жидкостью, но некоторое количество их остается связанным в клейковине и может быть обнаружено при ее анализе.
Действительно, многие исследователи, изучавшие химический состав клейковины, отмечали наличие в ней углеводов. Так, еще в 1906 г. Нортон (Norton) нашел в сухой клейковине 11,45% углеводов, а Дилл (,Dilt, 1925) даже 18,82%, причем главную часть этих веществ составлял крахмал. Данные Нортона и Дилла сильно преувеличены вследствие, может быть, недостаточного отмывания крахмала.
Во всяком случае, позднейшие исследования показали, что количество углеводов в клейковине, и в первую очередь крахмала, может быть значительно ниже. Например, Селливен и Нир (Sullivan, Near, 1927) приготовили клейковину, содержавшую 4,75—8,79% крахмала. В. С. Смирнов (1938) получил для пяти препаратов сухой клейковины следующие результаты.
Хорошо известно, что даже после того как промывная жидкость при отмывании клейковины перестает давать йодную реакцию на крахмал, последний еще содержится в клейковине и может быть обнаружен под микроскопом. По-видимому, между частицами белков клейковины и крахмалом возникают довольно прочные связи сорбционного характера. Но при длительном и тщательном отмывании можно полностью освободить клейковину от крахмала. Это было показано еще Герумом и Метцером (Gerum, Mctzer, 1923), отмывавшими клейковину до полного исчезновения видимых под микроскопом крахмальных зерен, Фишером и Гальтоном (Fisher, Haiton, 1936) при использовании механического прибора для отмывания и Кленденнингом (Clendenning, 1942), который разработал количественный метод определения крахмала в клейковине и показал как химическим, так и микроскопическим путем полную возможность получить клейковину, не содержащую крахмала. Позднее Лузена (Lusena. 1950) предложил метод приготовления очищенных препаратов сухой клейковины, практически свободных от крахмала.
Все эти данные позволяют сделать определенный вывод о том, что крахмал не является необходимым компонентом клейковины; он лишь трудноотделимая «примесь». То же самое можно сказать о клетчатке, частицы, которой в большей или меньшей степени задерживаются в клейковине, составляя иногда до 2% от сухого веса последней (Norton, 1906), хотя при более тщательном отмывании эта цифра снижается до 0,58% (Gerum, Metzer, 1923) или даже до нуля.
Что касается растворимых Сахаров, то присутствие их в клейковине является следствием как сорбционной, так, по-видимому, и чисто химической связи этих веществ с белками. В литературе имеются указания, что даже очищенные препараты клейкозинных белков (глиадина) содержат в своем составе некоторое количество редуцирующих Сахаров (Kiihl, 1933; Kondo, Sarata, цит. по Bailey, 1944), что говорит о прочной связи между белком и сахарами. Вопросу о взаимодействии белков клейковины с редуцирующими сахарами и влиянию этого взаимодействия на физические свойства клейковины и теста был посвящен за последнее десятилетие ряд исследований в связи с изучением так называемой «реакции потемнения» пищевых продуктов. Еще в 1912 г. Майард (Maillard, 1912) показал, что восстанавливающие сахара, как гексозы, так и пентозы, вступают в реакцию с аминокислотами, образуя темноокрашенные продукты — меланоидины. Дальнейшие исследования показали, что реакция меланоидинообразования имеет большое значение для цвета, вкуса и запаха многих пищевых продуктов (пиво, сыр, сухие яичные продукты, рисовые концентраты) и, в частности, хлебных изделий. В. Л. Кретович и его сотрудники (Кретович и Токарева, 1948, 1949, 1950; Кретович, Токарева, Петрова и Дроздова, 1951, 1953), а также Л. Я. Ауэрман и В. Л. Кретович с сотрудниками (Ауэрмги, Кретович, Алякринская, Базарнова, Токарева, 1953) подробно изучили химизм взаимодействия аминокислот и белков с редуцирующими сахарами при приготовлении ржаного и пшеничного хлеба и установили значение этой реакции для окраски хлебной корки, а также для аромата и вкуса мякиша. Было показано, что образование темноокрашенных меланоидинов протекает через промежуточное возникновение фурфурола, окисиметилфурфурола и летучих альдегидов, наличие которых в сочетании со спиртами, органическими кислотами и сложными эфирами теста обусловливает вкус и запах выпеченного хлеба. При гидротермической обработке зерна также происходит реакция меланоидинообразования (Коган, 1959). Хотя взаимодействие белков и углеводов наиболее интенсивно проявляется при высоких температурах и достаточном содержании влаги в материале, известно, что эти реакции медленно протекают и при низких температурах в пищевых продуктах с низкой влажностью, обусловливая потемнение их при длительном хранении. Таким образом, вполне обоснованно предположение о химическом соединении восстанавливающих Сахаров зерна с белками клейковины как при хранении зерна и муки, так и при замесе теста и отмывании клейковины. В последнее время этот процесс начинают рассматривать как одну из возможных причин изменения физических свойств, а, следовательно и качества клейковины. В главе о физических свойствах и строении клейковины мы подробно рассмотрим современные представления о ней как о сложном белковом агрегате, отдельные молекулярные цепи которого соединены поперечными связями или «мостиками» в трехмерную сетку.
От количества и расположения указанных «мостиков» зависят, по современным воззрениям, упруго-эластические свойства клейковины. Химическая природа поперечных связей или мостиков может быть, по-видимому, различной. Наибольшее значение до последнего времени придавали дисульфидным связям (—S—S—) между двумя полипептидными цепями, однако в ряде работ выдвигается представление об «углеводных мостиках» в клейковине. Френкель-Конрат и Олкотт (Fraenkel-Conrat, Olcott, 1948) в опытах с глиадином, зеином, полиглютамином, различными аминокислотами и амидами показали возможность образования метиленовых мостиков между первичными или вторичными аминными группами, с одной стороны, и первичными амидными или гуанидиловыми группами, с другой стороны, за счет реакции с альдегидной группой формальдегида.
Реакции осуществляются при комнатной температуре в широкой зоне рН от 3 до 8 и при известных условиях ведут к образованию геля в растворах глиадина и зеина. Хотя схемы реакций обоснованы главным образом модельными опытами на веществах менее сложных, чем природные белки, все же полученные результаты позволяют предполагать возможность «сшивания» полипептидных цепей разных белковых молекул в один агрегат через образование метиленовых мостиков за счет реакции белков с веществами, содержащими альдегидную группу.
Опираясь на эти данные, Глинка (Hlynka, 1949) высказал предположение, что восстанавливающие сахара могут служить источником образования поперечных связей между белковыми молекулами клейковины в тесте, изменяя, таким образом, физические свойства последнего. Вначале Глинка изучил действие уксусного альдегида на клейковину и тесто, подвергнутое предварительно обработке бисульфитом натрия (NaHS03). Под влиянием бисульфита клейковина становится слабой, липкой и неэластичной, тесто также заметно слабеет, однако прибавление небольших количеств уксусного альдегида к муке одновременно с бисульфитом полностью устраняет действие последнего. Более того, клейковина, уже испорченная бисульфитом, при отлежке в 0,5%-ном растворе уксусного альдегида в течение 1—2 часов восстанавливает свои первоначальные физические свойства и становится совершенно нормальной. Такое же действие, но в гораздо меньшей степени, оказывают формальдегид, ацетон, глюкоза и крахмал. Клейковина нормального качества под влиянием ацетальдегида немного укрепляется.
Описанные опыты показывают, что в известных условиях альдегидная группа способна влиять на физические свойства клейковины, однако они не дают подтверждения взглядам на образование поперечных мостиков между белковыми молекулами за счет их реакции с этой группой. Роль альдегида в опытах Глинки заключалась, вероятно, в связывании бисульфита и торможении тем самым реакции этого вещества с белком, в результате которой клейковина изменяла свое физическое состояние. Как указывает и сам автор, бисульфит вызывает, по-видимому, обратимое расщепление дисульфидных связей в клейкозине, а ацетальдегид препятствует этой реакции. Более подробно роль дисульфидных связей для физических свойств клейковины будет рассмотрена ниже в связи с действием восстановителей и окислителей на клейковинные белки. Здесь ограничимся указанием на большую сложность и пока еще совершенно недостаточную изученность явлений, описанных Глинкой, поскольку в его опытах было показано, что ацетальдегид способен восстанавливать первоначальные свойства клейковины, если она ослаблена не только бисульфитом, но также цистеином и сульфидом натрия, не реагирующими с а цет альдегидом, подобно бисульфиту, тогда как при ослаблении ее глютатионом или папаином ацетальдегид не оказывает регенерирующего действия. С другой стороны, целый ряд испробованных Глинкой восстановителей не изменял физических свойств клейковины, несмотря на значительную величину восстановительного потенциала этих веществ.
В последующих работах Глинка в сотрудничестве с Бассом и Андерсоном (Hlynka, Bass, 1949; Hlynka, Anderson, 1951) показал, что белки клейковины и глюкоза вступают во взаимодействие с образованием комплекса, обладающего редуцирующей способностью.
Из образцов пшеничной муки с высоким, средним и низким содержанием белка были приготовлены смеси следующего состава:
1) мука + глюкоза (2—5%);
2) сухая клейковина + глюкоза (2—5%);
3) мука замешана в тесто с 5%-ным водным раствором глюкозы, полученное тесто высушено и измельчено;
4) сухая клейковина превращена в сырую с добавлением 57о-ного водного раствора глюкозы, а затем вновь высушена и измельчена;
5) контроль: образцы муки, сухого теста и сухой клейковины без глюкозы.
Все эти смеси хранились при комнатной температуре в течение 5—7,5 месяцев. Содержание влаги в них составляло 7,6—12,7%. Перед началом и в конце хранения определялась редуцирующая способность смесей и их компонентов по методу Чепмана и Мак-Ферлейна (Chapman, McFarlane, 1945). Возрастание редуцирующей способности материала за период хранения (после удаления избытка непрореагировавшей глюкозы) указывало на степень взаимодействия белков и глюкозы с образованием редуцирующего белково-углеводного комплекса. Опыты показали, что во всех вариантах редуцирующая способность за период хранения росла, но в разной степени. Высокобелковая мука сильнее реагировала с глюкозой, чем низкобелковая. Особенно сильное возрастание редуцирующей способности (в 2,5—8 раз) наблюдалось при хранении тех смесей, которые были предварительно увлажнены (при замесе теста и клейковины на водном растворе глюкозы), а затем высушены. В этих вариантах редуцирующая способность была резко повышена уже при исходном анализе сухих смесей, что указывает на взаимодействие белков и глюкозы еще в период замеса теста и его последующего высушивания. Хранение таких смесей вело к дальнейшему росту их редуцирующей способности. Специальные опыты по хранению некоторых смесей в течение 18 часов «при повышенных температурах от ЭО до 70° позволили определить температурный коэффициент изучаемой реакции. Для теста он был найден равным 2,2, а для клейковины — 3,6.
Длительное отмывание водой (а также обезжиривание) клейковины из смесей, которые в результате хранения сильно увеличили свою редуцирующую способность, привело к ничтожному снижению этой способности, что указывает на прочную связь между клейковинными белками и глюкозой.
Авторы предполагают, что списанное ими связывание глюкозы белками пшеницы представляет собой первую стадию «реакции потеменения», причем восстанавливающие углеводы образуют поперечные мостики между молекулами белка. К сожалению, в цитированных работах Глинки и сотрудников нет никаких указаний на изменения качества клейковины в хранившихся смесях. Между тем предполагаемое образование углеводных мостиков должно было бы в первую очередь повлиять на физические свойства клейковины, изменение которых явилось бы важным подтверждением предлагаемой гипотезы.
Что касается растворимых Сахаров, не обладающих редуцирующей способностью, то в литературе нет указаний на взаимодействие их с белками клейковины. Относительно сахарозы известно, что прибавление ее к муке в больших количествах (60—120% от веса муки) препятствует образованию теста и сильно снижает выход клейковины. Бекстер и Хестер (Baxter, Hester, 1958) показали, что причина этого заключается в конкуренции между сахарозой и белками клейковины в отношении прибавленной к муке воды, что затрудняет набухание клейковины и снижает ее выход. Если же замесить тесто на чистой воде, а затем добавить сахарозу в количестве 60% от веса муки, то выход сухой клейковины не снижается, так как набухание ее прошло до прибавления сахарозы. По данным тех же авторов, качество клейковины не менялось при добавлении к муке сахарозы. В то же время показано, что 0,1-0,5 М растворы сахарозы пептизируют заметно больше клейковинного белка, чем чистая вода. Это согласуется со старыми данными Яго (Jago, 1911) об увеличении растворимости клейковины в 70%-ном спирте после добавления к нему 20% сахарозы.
За последние годы в литературе появились работы о взаимодействии белков клейковины с растворимыми полисахаридами. Юди (Udy, 1957) приготовил очищенные препараты во-дорастворимых полисахаридов из муки разных типов, путем осаждения ацетоном водных экстрактов муки, освобожденных предварительно от белков с помощью гидроксида бария и сульфата цинка. В зависимости от исходной муки полисахариды различались своим молекулярным весом, определяемым по вязкости их растворов в воде и разбавленных кислотах. Автор готовил растворы (0,5%) полисахаридов и клейковины в разбавленной молочной или уксусной кислоте и измерял вязкость этих растворов как отдельно, так и при смешивании. При отсутствии взаимодействия компонентов вязкость смеси может быть вычислена по вязкости отдельных ее составных частей, в данном случае полисахаридов и клейковины. Если же в смеси компоненты взаимодействуют, то наблюдаемые значения вязкости будут отклоняться от вычисленных величин. В опытах Юди почти всегда фактическая вязкость смеси была значительно больше, чем вычисленная, что указывает на образование комплекса между клейковиной и полисахаридами. Степень взаимодействия обоих веществ увеличивалась с повышением молекулярного веса полисахаридов. В некоторых опытах, особенно при более высоком содержании клейковины в смеси, происходило образование гелей. Предварительное прогревание растворов полисахаридов и клейко-вины препятствовало комплексообразованию и измеренная вязкость смеси начинала совпадать с вычисленной. По-видимому, комплекс клейковины и полисахаридов не является особенно прочным, и взаимодействие этих веществ объясняется не возникновением валентных связей или «мостиков», но скорее всего, зависит от более слабых вторичных молекулярных сил. Если, например, ослабить электростатическое взаимодействие компонентов путем увеличения ионной силы растворителя, то образование комплекса не происходит. Это видно из опытов, где измерялась вязкость смеси клейковины и полисахаридов, диспергированных в 8%-ном водном растворе салицилата натрия, обладающем высокой ионной силой. В этом случае наблюдаемая вязкость смеси в точности совпадала с величиной, вычисленной по вязкости отдельных компонентов в том же растворителе, т. е. никакого взаимодействия клейковины и полисахаридов не было.
Интересно, что прибавление восстановителей — бисульфита и тиогликолевой кислоты — к смеси клейковины и полисахаридов з разбавленной уксусной кислоте препятствовало их взаимодействию, и наблюдаемая вязкость смеси совпадали с вычисленной. В противоположность этому добавление броматов способствовало взаимодействию компонентов и ускоряло образование гелей в смесях клейковины и полисахаридов. Возможно, что окисление определенных групп в молекулах полисахаридов создает возможность химического взаимодействия веществ с белками клейковины дополнительно к описанному выше взаимодействию за счет более слабых молекулярных сил. В этой связи заслуживает внимания недавняя работа Нейкома и Дойела (Neukom, Deuel, 1958). Эти авторы подвергли пшеничный крахмал обработке перйодной кислотой для окисления гидроксильных групп всех глюкозных остаткоз крахмала в диальдегиды. Прибавление окисленного таким образом крахмала к муке (в количестве 0,03—0,15% от ее веса) вызывало явное изменение физических свойств теста, измеряемых экстенсографом. Тесто становилось более крепким, менее растяжимым, а при высоких дозах окисленного крахмала — слишком крепким, жестким. Объем хлеба при оптимальной дозе окисленного крахмала повышался, а при избытке его падал. Эти опыты позволяют предполагать, что окисленные полисахариды реагируют своими альдегидными группами с аминными группами белков клейковины аналогично простым восстанавливающим сахарам, т. е. путем образования промежуточных мостиков между белковыми молекулами, что приводит к изменению физических свойств клейковины в направлении ее укрепления. Нейком и Дойел, так же как и Юди, пытаются установить связь между улучшающим действием окислителей типа броматов и возможным укреплением клейковины в результате ее взаимодействия с полисахаридами, окисленными этими улучшителями. При этом справедливо отмечается, что большинство обычных улучшителей (бромат калия, йодат натрия и др.) являются очень слабыми окислителями, неспособными окислить гидроксильные группы крахмала. Гораздо легче окисляются растворимые пентозаны муки, которым, возможно, принадлежит определенная роль в процессе улучшения физических свойств клейковины и теста при добавлении к нему броматов.
Подведя итоги изложенному выше материалу о связи белков клейковины с растворимыми углеводами (простыми сахарами и полисахаридами), можно сделать следующие заключения. При известных условиях возможно, по-видимому, химическое взаимодействие белков клейковины с редуцирующими сахарами, а может быть и с растворимыми полисахаридами или продуктами их окисления. Хотя в настоящее время еще не доказано, что растворимые углеводы, соединяясь с клейковиной, образуют поперечные связи — «мостики» между молекулами клейковинных белков, поскольку возможны и другие типы связи, само присутствие углеводов в препаратах клейковины нельзя, по-видимому, приписывать только плохой ее очистке. Можно думать, иго растворимые углеводы могут быть внутренними компонентами клейковинного комплекса, а не только трудноотделимыми примесями. Как влияет присутствие углеводов в составе клейковины на ее физико-химические свойства, до настоящего времени не выяснено. Если исходить из гипотезы об углеводных мостиках между белковыми молекулами клейковины, то увеличение содержания углеводов в клейковинном комплексе должно изменять сто физические свойства в сторону укрепления, однако экспериментальных данных для решения этого вопроса совершенно недостаточно. Неизвестно также, насколько обязательным компонентом клейковины являются углеводы, т. е. может ли существовать клейковина, совершенно не содержащая в своем составе углеводов. Исходя из незначительного количества растворимых Сахаров в очищенной клейковине, а также принимая во внимание списанные ниже опыты по приготовлению «синтетической клейковины» из чистых препаратов глиадина и глютенина, нужно думать, что углеводы не являются обязательными компонентами клейковинного комплекса, хотя практически они постоянно присутствуют в его составе благодаря соединению с основным веществом клейковины — белком.