Существуют самые противоречивые мнения относительно продолжительности срока, в течение которого сперма должна контактировать с глицерином до замораживания.
Метод Полджа с контактом в течение 18— 24 час дает хорошие результаты, если судить по таким показателям, как подвижность сперматозоидов после замораживания и оттаивания и процент коров, забеременевших в результате искусственного оплодотворения. Согласно О’Деллу и Херсту, процент бычьих сперматозоидов, переживших замораживание в глицеринизированном цитратно-желточном разбавителе или в снятом молоке, был выше в пробах, замороженных вскоре после добавления глицерина, по сравнению с теми, которые уравновешивались со средой в течение 18 час. Эмменс и сотрудники утверждали, что для уравновешивания спермы с глицериновым разбавителем достаточно 30 мин. Использованный ими разбавитель, помимо глицерина и цитрата натрия, содержал арабинозу и фосфатные буферы. Эти компоненты могут настолько изменить условия опыта, что немедленное замораживание становится возможным и даже желательным. Позднее, однако, Эмменс и Мартин установили, что не наблюдалось различий в проценте забеременевших коров при осеменении спермой, пробы которой перед замораживанием уравновешивались с глицерином в течение нескольких часов, и спермой, замороженной после кратковременного уравновешивания. Сравнительно недавно Блекшоу и др. сообщили, что уравновешивание в течение 18 час повышало выживаемость сперматозоидов в пробах, замораживавшихся для продажи. Большинство исследователей получали лучшие результаты при замораживании спермы после уравновешивания с глицерином на протяжении 6—18 час.
Полдж показал, что оживление обработанных глицерином бычьих сперматозоидов после замораживания зависит от многих факторов, которые в свою очередь связаны со скоростью замораживания. Существует критическая температурная зона от —15 до —25°, в пределах которой повреждения, по-видимому, происходят вследствие или чрезмерно быстрого, или чрезмерно медленного охлаждения. Сперматозоиды, находившиеся 18 час в среде, содержавшей яичный желток, цитрат натрия и глицерин, были более устойчивы к повреждениям в критической температурной зоне. Сперматозоиды, находившиеся непродолжительное время в среде, содержавшей глицерин, могут быть устойчивы к повреждениям в этой температурной зоне лишь при очень быстром охлаждении. Следовательно, имеющиеся в литературе противоречия относительно важного значения уравновешивания с глицерином перед замораживанием, возможно, связаны с применением различных скоростей замораживания в пределах указанной критической температурной зоны. Полдж отмечает, что положительное влияние, которое оказывает на сперматозоиды продолжительное уравновешивание со средой, вероятно, обусловлено действием не глицерина, а других компонентов. Например, защитное действие липидов и липопротеидов против температурного шока усилится, если сперматозоиды перед охлаждением будут более продолжительное время соприкасаться с этими веществами. В настоящее время известно, что в сперматозоидах и обмен липидов происходит весьма интенсивно.