Результаты, полученные последующими исследователями, находились в полном противоречии с высказываниями Пиктэ и опровергали точку зрения, согласно которой пойкилотермные животные переживают полное замораживание.
Например, Фишер утверждал, что виноградная улитка (Helix pomatia) не переживает воздействие температур ниже —5 или —6°. Камерон и Браунли установили, что лягушки Rana pipiens переживали понижение температуры внутри тела до —1°, но погибали, когда она падала до —1,8°. Эти авторы обнаружили, что в тех случаях, когда животные подвергались воздействию низких температур, у них температура внутри тела снижалась крайне медленно. Они охлаждались так же, как охлаждается соответствующий объем физиологического, изотонического с кровью раствора. Процесс замораживания не заканчивался еще после многочасового пребывания при температуре ниже точки замерзания крови или физиологического раствора. Так, тело лягушек, находившихся в течение 1 час при температуре —25°, было совершенно твердым и казалось насквозь промерзшим. Скелетные мышцы содержали лед, но внутренние органы не промерзли и сердце продолжало сокращаться. Температура внутри тела не достигла летального уровня —1,8°, и интактные животные ожили. Интересно, что сердце после замораживания при —2,5° вновь начало сокращаться и что скелетная мышца и периферические нервы также функционировали, хотя они были заморожены при температурах, обычно летальных для интактных животных. Было сделано заключение, что маловероятно, чтобы лягушки переживали замораживание при низкой температуре воздуха в таких холодных областях, как Северная Канада, и что они переживают зимний период, по-видимому, зарывшись в тину или ил, где температура сохраняется на уровне выше —1°. В СССР Калабухов и Мацко с сотрудниками также установили, что лягушки и жабы переживают частичное замораживание поверхностных тканей, но погибают при полном замораживании, когда температура внутри тела падает ниже —1°. Геологи, находившие в глыбах льда лягушек, которые оживали после освобождения их из ледяной оболочки, редко регистрировали температуру среды, окружавшей животных. Она могла равняться 0°, а если и была ниже 0°, то все равно внутренние органы могли оставаться незамерзшими и при температуре около —1°.
До недавнего времени многие физиологи находились под впечатлением того факта, что профессору Люйету удалось оживить золотых рыбок, которые были погружены в жидкий воздух и тела которых стали ломкими в связи с полным вымерзанием всей жидкости в организме. Между тем факты, сообщенные Люйетом, говорят, что золотая рыбка переживает погружение в жидкий воздух на различные сроки, но не более 15 сек. Тела рыбок, которые впоследствии ожили, не промерзли целиком и не стали ломкими. При воздействии жидкого воздуха в течение 35 сек и более тела становились ломкими и рыбки не оживали. Люйет показал, как искусный фокусник может убедить аудиторию в том, что рыбка, ожившая после пребывания в жидком воздухе, находилась в нем такое же время, как и те, которые были разломаны пополам. Возможно, сам того не желая, он ввел в заблуждение даже некоторых сотрудничавших с ним исследователей. В начале XX в. многие ученые изучали действие замораживания на рыб различных видов, регистрируя у них температуру внутри тела. Они пришли к единодушному мнению о том, что животные в состоянии пережить образование льда в коже и других поверхностных тканях, в результате чего их тело становится твердым и буквально окостеневшим. Однако они погибали, если период замораживания продолжался достаточно долго, а температура была настолько низкой, что происходило полное промерзание внутренних органов. Следовательно, наблюдения Пиктэ были, по-видимому, ошибочными. Теория Бахметьева, согласно которой насекомые и другие пойкилотермные животные могут переживать продолжительное замораживание в состоянии анабиоза, подверглась критике, несмотря на его оговорку, что при падении температуры ниже критического уровня наступает смерть.
В противоположность золотым рыбкам уксусные угрицы (Anguillula acetl) оживали после погружения в жидкий воздух на сроки, достаточные для замораживания их при этой температуре (приблизительно —190°). Успех оживления зависел от очень быстрого согревания и увеличивался при предварительной обработке угриц 30-процентным раствором этиленгликоля, который, как полагают, вызывал дегидратацию. Была выдвинута теория, согласно которой успех выживания в этих случаях зависел от витрификации протоплазмы во время быстрого охлаждения и перехода ее из стеклообразного состояния в жидкое в процессе быстрого оттаивания, благодаря чему в ней не успевали образовываться кристаллы льда. При медленном согревании, особенно при температурах выше —43°, организмы погибали, по-видимому, вследствие наступления кристаллизации. Казалось бы, нет никакой возможности охлаждать и согревать более крупных, чем уксусные угрицы, животных настолько быстро, чтобы обеспечить витрификацию жидкостей внутри организма и предотвратить их кристаллизацию.
Образования кристаллов льда при низких температурах можно избежать при помощи полного высушивания организма до его охлаждения. Беккерель в многочисленных опытах, проведенных им за период между 1905 и 1951 гг., нашел, что такие мелкие животные, как коловратки и тихоходки, выживающие после обезвоживания при температурах выше нуля, могут в высушенном состоянии пережить воздействие температуры любого жидкого атмосферного газа. Он охлаждал также высушенные организмы до долей градуса Кельвина (—273°) при помощи метода адиабатического размагничивания железных квасцов в жидком гелии. После согревания и увлажнения эти организмы оживали, хотя условия, в которых они находились, полностью исключали проявление каких-либо химических процессов, присущих жизни. Приведенные замечательные результаты послужили дальнейшим подтверждением теории, согласно которой выживание организмов при очень низких температурах возможно только в том случае, если удастся избежать кристаллизации льда. К сожалению, нет никакой надежды, что удастся применить эту методику в опытах на большей части видов беспозвоночных, а также на каких — либо позвоночных животных. Потеря ими определенной доли общего объема жидкости (величина этой доли зависела от вида, но все же была сравнительно небольшой) вызывала летальный исход при любой температуре.
Интенсивное изучение механизма, благодаря которому насекомые переживают воздействие низких температур, натолкнуло на мысль о том, что в некоторых случаях холодовое затвердение обусловлено уменьшением содержания воды. Частичное обезвоживание вызывает понижение температуры замерзания крови и тканевых жидкостей. Более концентрированные жидкости можно также переохлаждать до более низкой температуры. Способность этих жидкостей оставаться в переохлажденном состоянии, не замерзая, при понижении температуры до —20°, а иногда и до —40° имеет существенное значение. Она помогает многим насекомым, обитающим в Канаде и других северных странах, переносить самые жестокие морозы. Однако иногда переохлажденные насекомые замерзают, и это влечет за собой летальный исход. Процесс начинается с образования одного центра кристаллизации льда. Вероятность появления таких центров повышается по мере увеличения длительности переохлаждения. Чем ниже температура, тем больше шансов на образование и дальнейший рост кристаллов льда в переохлажденной жидкости или в ткани насекомых. Таким образом, попытки добиться выживания отдельных особей в состоянии переохлаждения связаны с определенным риском. Вместе с тем с экологической точки зрения, несомненно, возможность выживания в таких условиях играет очень важную роль для ряда видов, место географического распространения которых в противном случае резко ограничивается. Точные измерения температуры выявили еще один замечательный фактор защиты и изоляции от холода у перезимовывающих организмов — кокон, почва, остатки листвы и растений, снег. Многие насекомые переживают суровые зимние холода в, сравнительно мягких микроклиматических условиях при температуре выше точки замерзания жидкостей организма, допускающей длительное пребывание их в переохлажденном состоянии.
Регистрация температуры внутри тела показала, что другие пойкилотермные животные, в том числе лягушки, жабы, ящерицы, черепахи и змеи, переживают переохлаждение до температуры от —5 до —10°. Можно было даже определить количество потребляемого кислорода у ящериц, переохлажденных до температуры от —4,5 до —7,8°. Следовательно, некоторые пойкилотермные позвоночные, зимующие в различных укрытых местах, во время своей естественной спячки пребывают в состоянии переохлаждения.