Гонсалес и Люйет испытывали влияние быстрого охлаждения на изолированное сердце куриного эмбриона после 36—48 час инкубации.
На этой стадии биения сердца хорошо заметны, а вся масса эмбриона еще очень мала. Эмбрионы подвергали воздействию 30-процентного раствора этиленгликоля в течение примерно 6 мин, а затем после удаления излишней влаги погружали в жидкий азот. Через 1 мин, а в некоторых опытах через 1 час их оттаивали в растворе Тироде с температурой +40°. Проделав около сотни неудачных опытов, авторы, наконец, добились восстановления сердечной деятельности у одного из эмбрионов, а затем и в последующих опытах полупили успешные результаты: у 38 из 65 эмбрионов, обработанных этиленгликолем, восстановились биения сердца. В некоторых случаях сокращалась только часть сердца, а в других удары были не очень интенсивными и частыми. В ряде опытов сердце билось не более получаса после согревания, а в одном после воздействия жидким азотом оно продолжало сокращаться 20 час. Кусочки сердца эмбрионов более старшего возраста, инкубированных в течение 7—15 дней, также переживали обработку этиленгликолем и погружение в жидкий азот, как показывал бурный рост тканевых культур после согревания. Хранение в течение 1 месяца в жидком азоте не влияло на интенсивность роста культивируемых кусочков сердца эмбриона.
В это же время проводились опыты по продолжительному хранению сперматозоидов, эритроцитов и тканей яичника птиц и млекопитающих при температуре —79° в содержащей глицерин среде после относительно медленного охлаждения. Люйет и Гонсалес решили испытать действие глицерина на сердце куриного эмбриона. Они обнаружили, что кусочки сердца 10—15-дневных эмбрионов переживали обработку 30- или 60-процентным раствором глицерина и после воздействия жидким азотом при культивировании давали бурный рост, иногда даже более интенсивный, чем в контрольных, неохлаждавшихся культурах. Результаты культивирования показали, что глицерин так же эффективно защищал сердечную мышцу эмбриона от повреждений при очень низких температурах, как и этиленгликоль. Обработанные глицерином кусочки сердца куриного эмбриона, помещенные в узкие стеклянные пробирки, медленно охлаждали в бане с температурой —30°. Спустя примерно 10 сек в тканях начинался процесс кристаллизации. На это указывало резкое изменение их внешнего вида — из прозрачных они становились мутными. Спустя 10 мин после замораживания пробирки согревали. При культивировании у 39 кусочков из 40 наблюдался такой же интенсивный рост, как и у незамороженных контрольных, тогда как замороженные, но не обработанные глицерином кусочки ткани совершенно не дали роста. По мнению Люйета и Гехенио, выживание сердечных волокон, охлажденных до —30°, зависело, по крайней мере частично, от высокого содержания воды не вымерзшей благодаря глицерину при данной температуре. Кусочки сердца куриного эмбриона, обработанные этиленгликолем, также переживали воздействие жидким азотом, если их охлаждали до той же температуры в течение приблизительно 30 сек, а не сверхбыстрым способом, который ранее считали наиболее эффективным. Предварительная обработка концентрированными растворами глюкозы (1,5—4,2 М), которая якобы эффективно обезвоживает ткани, плохо защищала пробы от быстрого замораживания в жидком азоте. Кусочки сердца эмбриона, обработанные растворами с концентрацией хлористого натрия более 1 М, также не переживали погружения в жидкий азот. Полученные результаты позволяют предполагать, что дегидратация посредством осмоса не является лучшим способом защиты живых клеток против последующего воздействия очень низких температур. Эти результаты показали также, что при наличии в среде глицерина или этиленгликоля образование кристаллов льда в среде не повреждало клетки.
Сравнительно недавно Рэ провел новые исследования выживаемости сердца куриного эмбриона после замораживания его при очень низких температурах и последующего оттаивания. Используя методику Вольфа для получения культуры органов, он определял физиологическую активность сердца эмбриона, извлеченного из яйца, которое было инкубировано в течение 7,5 дней. Рэ различал шесть степеней активности, от биения верхушки изолированного желудочка до координированных ударов обоих предсердий и желудочков с частотой, изменявшейся в зависимости от температуры (32—38°). Для сверхбыстрого замораживания сердце помещали на алюминиевую пластинку и погружали непосредственно в жидкий пропан, который охлаждали до температуры жидкого азота. Поскольку при погружении теплого материала в жидкий пропан с температурой —196° не образуется пузырьков газа, теплообмен происходил быстрее и спустя 0,5 сек температура сердца достигала —196°. Через 15 сек сердце переносили из жидкого пропана в жидкий азот. В других опытах сердце помещали на алюминиевую пластинку и погружали в жидкий азот. Температура сердца снижалась до —196° через 1,5 сек. Медленное замораживание осуществляли двумя способами. В одних опытах предметное стекло с сердцем помещали в пробирку из пирексового стекла и последнюю погружали в жидкий азот. Снижение температуры до —196° происходило в течение 1 мин. В других опытах сердце сначала замораживали в течение 40 сек при —30°, а затем погружали в жидкий азот. До замораживания сердце пропитывали в течение 30 мин уравновешенным солевым раствором Эрла, содержащим глицерин в различной концентрации. В первой серии опытов производили быстрое оттаивание, погружая сердце в физиологический раствор с температурой +20°. При отсутствии в среде глицерина все препараты погибали. Оптимальная концентрация глицерина при любой скорости охлаждения составляла 30%. Обработанное глицерином сердце, охлажденное до —196° в два приема или же в течение 65 сек, после оттаивания проявляло большую физиологическую активность, чем сердце, замороженное очень быстро в жидком пропане или непосредственно в жидком азоте. Скорость оттаивания после замораживания при —196° оказывала значительно большее влияние на последующую сердечную деятельность, чем скорость охлаждения. Препараты предварительно обрабатывали глицерином и охлаждали с оптимальной скоростью. Почти не восстанавливались (или восстанавливались в очень небольшой степени) препараты, оттаивание которых при температуре воздуха +20° осуществляли медленно в течение 6 мин. При оттаивании за 45 сек не наблюдалось полного восстановления, тогда как препараты, обработанные 30-процентным раствором глицерина, замороженные при —196° и оттаянные за 1 сек, обладали максимальной активностью. Некоторые сердца хранили в течение нескольких недель при температуре твердой углекислоты (—79°). После быстрого оттаивания наблюдалось восстановление почти нормальной сердечной деятельности. Рэ полагал, что частичная защита сердечной мышцы более слабыми растворами глицерина, в результате чего физиологическая активность сердца после оттаивания снижалась, была связана с гибелью части мышечных волокон. Некоторые волокна могли быть менее устойчивыми или же процесс замораживания в них протекал более резко.