Кроме основных методов, к которым относятся РА, РСК и РДСК, в практических условиях возникает необходимость применения вспомогательных методов серологической диагностики. Ниже излагаются наиболее изученные из этих методов.
Пластинчатый метод реакции агглютинации с антигеном, окрашенным краской Rose Bengal (RBPT). Разработан несколько лет тому назад в США и используется как официальный метод (Brewer) диагностики бруцеллеза в этой стране. Сущность реакции состоит в том, что окрашенный антиген, обработанный кислым буферным раствором, соединяется с плазмой крови, которую получают и небольших пробирках с кровью, и веществом, отделяющим плазму от клеток. Для постановки реакции Бревера берут кровь в небольшие пластиковые трубочки, содержащие гепарин и фитогемагглютинин, который способствует быстрому осаждению эритроцитов, освобождая плазму крови. В Англии используют вместо плазмы сыворотку крови. Антиген, рекомендованный для этой реакции Комитетом экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ, содержит буфер при pH 3,65 с плотностью клеток бруцелл, составляющей 8%. Реакцию ставят на плотном белом картоне или на плитках. Берут 0,03 мл неразведенной сыворотки или плазмы крови и такое же количество окрашенного антигена, хорошо смешивают стеклянной палочкой в обоих направлениях в течение 4 мин, после чего учитывают результат. Отмечают, что реакция может наступить и у небруцеллезных животных. В стадах, привитых ранее вакциной из штамма № 19, процент ложноположительных реакций может быть очень высоким.
Ценность метода состоит в том, что он может быть применен в полевых условиях. В Англии (Мак-Диармид, 1970) пробы, давшие положительный результат по пластинчатой реакции, исследуют по РСК, на которой предшествующая прививка животных вакциной из штамма № 19 отражается меньше, чем на РА.
Сущность пластинчатой реакции с антигеном, окрашенным краской Rose Bengal, подробно изучал Корбель (Corbel, 1972, 1973). Автор нашел, что основным фактором специфичности метода является pH среды, тогда как краситель Rose Bengal может быть без ущерба для результатов реакции заменен triphinyl-methane или акридинным оранжевым и другими красителями. Антиген для пластинчатой реакции он готовил из стандартных для пробирочной РА клеток Br. abortus, взвесь которых осаждал на центрифуге при 6000 об/мин в течение 20 мин. Затем взвесь бруцелл 3-кратно промывал на центрифуге в солевом растворе и вторично суспензировал в 0,15 М NaCl, имеющем разное значение pH — от 1 до 7 с лактатным или фосфатным буфером (т. е. ниже и выше значения pH 3,65, рекомендованного для стандартного антигена).
В опытах оказалось, что при значениях pH 1, 2, 3 феномен реакции агглютинации не наступал с позитивными сыворотками. При pH 3,65 и 4 показания были одинаковыми и самыми низкими по охвату инфицированных животных. При pH ниже 2 антигены проявляли тенденцию к аутоагглютинации. В опытах, где значение pH было 4,5, число сывороток, реагирующих с антигеном, стало увеличиваться и достигло максимального уровня при pH 6. Автор склонен считать, что этим методом выявляются антитела иммуноглобулинов класса IgG.
Реакция агглютинации с применением меркаптоэтанола. Методика реакции основана на введении в сыворотку 0,1 М 2-меркаптоэтанола. Реакцию ставят по схеме пробирочной РА. Альтон (1970) вначале исследовал экспериментально зараженных коз и их потомство обычной РА, разбавителем в которой был 5%-ный раствор хлорида натрия как для разведения сыворотки, так и для разведения антигена. Начальное разведение сыворотки было 1 : 10, а дальше производил последовательное разведение ее в 2 раза (1 : 20, 1 : 40 и т. д.). Разведенный антиген вводил в сыворотку в таком же объеме (0,5мл). Следовательно, в первой пробирке результат при наличии 50%-ного титра или выше расценивался как 20 МЕ/мл, во второй пробирке — 40 МЕ/мл и т. д. Положительные пробы исследовал с нормальным солевым раствором (0,85%-ным), в который вводил до 0,1 М меркаптоэтанолового спирта для разведения как сыворотки, так и антигена. Результаты оценивались на основании предположения, что стандартный тест РА выявляет общие агглютинины, а меркаптоэтаноловый — агглютинин IgG (7 S). Разница титров двух проб указывает на количество агглютинина IgM (19 S), присутствовавшего в данной сыворотке, но разрушенного меркаптоэтанолом.
Наджи, Сорейм (Nagy a. Sorheim, 1969) сравнивали показания РСК, РА с тепловой инактивацией и РА на меркаптоэтанолоном разбавителе. Было проверено 5763 головы крупного рогатого скота. Меркаптоэтаноловый тест ставили по технике пробирочной РА, но вместо формалинизированного нормального солевого раствора брали 0,1 М меркаптоэтанолового раствора в таком же (0,85%-ном) солевом растворе.
Тепловую реакцию агглютинации проводили так же, как и пробирочную, но стой разницей, что после соединения разведения сыворотки с разведением антигена пробирки выдерживали при 65° С в течение 15 мин, затем их охлаждали до 18° С в холодной воде, центрифугировали в течение 15 мин при 1000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляли, а в пробирки вводили 0,6 мл изотонического раствора хлорида натрия. РСК проводили с разведением сывороток 1:5, 1 : 10.
Все результаты оценивали эквивалентно к интернациональной стандартной сыворотке.
Получены следующие сравнительные данные. Совпадение меркаптоэтанолового теста с показаниями РСК отмечались в 96% случаев, 88% совпали с показаниями РА и в 86% с РА после тепловой инактивации сывороток.
Пиле и Тома (1969) на основании результатов опытов, проведенных с искусственным заражением и вакцинацией крупного рогатого скота, овец и крыс, пришли к выводу, что различить вакцинированных от зараженных вирулентной культурой животных было невозможно при применении медленной сероагглютинации и параллельного теста меркаптоэтанола.
Николетти (1969) сообщил о результатах исследования крупного рогатого скота, у которого бруцеллезная инфекция была подтверждена бактериологически и разными дополнительными серологическими методами. Оказалось, что стандартной классической реакцией агглютинации выявлено 52% животных-бруцеллоносителей; пластинчатой реакцией с окисленным и окрашенным Rose Bengal антигеном —95%; реакцией с применением 2-меркаптоэтанолового спирта (RBPT) — 97%; РСК — 98%; риванолевым преципитационным тестом —96%. Риванолевый тест осуществляется путем добавления в сыворотку раствора риваноля. Протеины сыворотки, отличающиеся от гамма-глобулинов, осаждают на центрифуге и удаляют, а супернатант (содержащий глобулины) исследуют быстрым пластинчатым или пробирочным методом.
Кольцевая реакция (КР). КР является наиболее апробированным и широко распространенным методом предварительного или разведывательного обследования на бруцеллез стад коров и отдельных животных. Этот метод применяется также для исследования молока овец. Большие опыты в этом направлении провели Эбанди (Ebandi, 1971), Матур (Mathur, 1970) и др. Особая ценность метода состоит в том, что можно проводить контроль на бруцеллез сборного молока в бидонах без особой затраты труда и средств. Причем этот контроль можно проводить постоянно, а не спорадически. Пробы молока для определения титра антител можно разводить молоком здоровых коров. Титры выше 1 : 10, по рекомендации Комитета экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ, считаются диагностическими. Колебания титров в отдельных четвертях вымени указывают на бруцеллезную инфекцию, а одинаковый титр во всех четвертях вымени — скорее на поствакцинальные титры. И хотя КР показывает иногда неспецифические положительные реакции и гораздо чаще дает отрицательный результат у зараженных бруцеллезом коров, Комитет экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ, основываясь на большом объеме информации из многих стран, рекомендует эту реакцию для широкого применения во всех странах в качестве дополнительного метода.
По данным Кисса (1972), в пробах молока с положительной кольцевой реакцией и в пробах с неспецифической реакцией обнаруживались иммуноглобулины IgG и IgM. В пробах молока с отрицательной КР эти глобулины установлены в относительно меньшем количестве.
Кольцевая реакция в СССР изучалась многими авторами и получила хорошую оценку.
Была установлена (П. А. Триленко, 1956) специфичность КР при исследовании до 20 000 проб молока в разных по эпизоотической характеристике хозяйствах. Особенно хороший результат был получен в свежеинфицированных стадах. Кроме того, КР можно применять для исследования сливок, разведенных 1 : 1 10%-ным раствором хлорида натрия или молоком здоровой коровы. Кислотность свыше 34° Т снижает показания КР, но ее легко устранить, добавив 1—2 капли насыщенного раствора гидрокарбоната натрия на 1 мл молока. Установлено, что молоко овец лучше разводить 1 : 1 10%-ным раствором хлорида натрия, что значительно улучшает результат исследования.
Этот метод регламентирован в СССР Министерством сельского хозяйства для установления предварительного диагноза на бруцеллез в стадах крупного рогатого скота и для исследования рыночного молока.
Была установлена также (П. А. Триленко, 1956) принципиальная пригодность КР для исследования сывороток крови на 711 пробах, в том числе крупного рогатого скота —- 599, овец — 62, лошадей — 18 и свиней — 32. Все пробы крови получены из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств. Исследование проводили следующим образом. Молоко здоровой коровы разливали по 2 мл в 3 пробирки, в каждую из которых добавляли по 0,2 мл 20%-ного раствора хлорида натрия.
Затем вводили исследуемую сыворотку: в первую пробирку — 0,15 мл, во вторую — 0,1 мл и в третью — 0,05 мл; в заключение во все пробирки добавляли по 0,15 мл цветного антигена КР. Пробирки выдерживали 2 ч в термостате при 37—38 С, после чего учитывали результат. Из 711 проб крови по РСК было положительных — 136, по КР с сывороткой крови — 101 и по РА (пробирочный метод) — 64 пробы.
В литературе имеются указания на некоторое совершенствование КР. Так, например, Танвани и Патгак (Tanwani, Pathak) считают окраску антигена тетразолом более предпочтительной, чем окраску гематоксилином.
Холмс (1967) предлагает индивидуальные пробы молока исследовать в тонких пробирках, куда вначале нужно вводить 1 мл молока здоровой коровы, а затем 0,03 мл (одна капля) исследуемого молока и по 1 капле окрашенного антигена.
В СССР продолжает широко испытываться метод исследования сывороток крови кольцевой реакцией. Большие опыты проведены В. Т. Котовым, Л. С. Герман и Б. Т. Артемовым (1957, 1960), С. И. Муратовым (1966), Б. Т. Артемовым (1971), показавшими, что КР с сывороткой крови более удобная и чувствительная, чем пробирочная РА.
Антиглобулиновая проба (модификация реакции Кумбса). Эта проба основана на определении неполных антител. В настоящее время она испытывается в двух вариантах.
Первый вариант. В СССР М. И. Чернышова с соавторами (1969) вначале исследовала сыворотки в пробирочной РА в 5—8 разведениях (от 1 : 50 и выше). Бруцеллезный антиген авторы применяли типированный к интернациональной стандартной сыворотке. Затем по 3 пробирки с отрицательной и слабоположительной пробами в РА центрифугировали при 2 000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок дважды промывали в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия на центрифуге. К осадку добавляли 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия и 0,1 мл антиглобулиновой сыворотки, разведенной по титру (1 : 30 или 1 : 80). После встряхивания пробирки ставили в термостат на 24 ч, после чего учитывали результат. Контролем служили пробы отмытого антигена РА, смешанного с 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия и 0,1 мл антиглобулиновой сыворотки в титре. Антигеном для исследования проб крови крупного рогатого скота является антиглобулин крупного рогатого скота для исследования проб крови овец — аитиглобулин овец и т. д.
Выявление неполных антител методом Кумбса у крупного рогатого скота не нашло широкого практического применения, так как грань оценки между положительной и отрицательной пробами очень близка.
Второй вариант. Этот вариант (Хайди) отличается от первого тем, что исследуемую сыворотку вначале подогревают в течение 15 мин при 70° С, затем смешивают с бруцеллезным антигеном (РА). После выдерживания в термостате в течение 2—3 ч клетки промывают на центрифуге изотоническим раствором хлорида натрия и к осадку добавляют антиглобулиновую сыворотку данного вида животных в титре, выдерживают в термостате 14—16 ч и учитывают результат на следующий день.
Реакция Кумбса в указанных модификациях с сыворотками крупного рогатого скота применялась во многих странах, преимущественно с целью разведывательного метода. Для целей диагностики бруцеллеза рекомендована Комитетом экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ (1971 г.) только для овец в модификации Haidi (с прогретой сывороткой). По данным Комитета, эта методика специфична при исследовании сывороток крови непривитых овец, но выявляет в среднем 70% больных животных.
По данным Висниовски (Wisniovski, 1973), в Польше этот метод широко применяется для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота.